1-Deoxynojirimycin Alleviates Insulin Resistance via Activation of Insulin Signaling PI3K/AKT Pathway in Skeletal Muscle of db/db Mice
Qingpu Liu, Xuan Li, Cunyu Li, Yunfeng Zheng and Guoping Peng
Molecules, 2015, 20, 21700–21714
https://doi.org/10.3390/molecules201219794
Перевод: Е. Крохмалева Редактура: Н. Готманова
Ключевые слова: листья шелковицы; 1-дезоксиногиримицин; мыши db/db; резистентность к инсулину; инсулин-регулируемый сигнальный путь; скелетные мышцы; PI3K/AKT; транслокация GLUT4
Краткое содержание
1-Дезоксиногиримицин (DNJ) широко используется для лечения сахарного диабета в качестве ингибитора α-глюкозидазы тонкого кишечника. Однако об эффектах данного соединения на повышение восприимчивости к инсулину имеется мало сообщений. Цель настоящего исследования – выяснить, способен ли DNJ снижать гипергликемию за счет повышения чувствительности к инсулину. С этой целью был разработан экономичный метод получения больших количеств DNJ. Далее мышам db/db вводили DNJ внутривенно (20, 40 и 80 мг·кг-1·день-1) в течение четырех недель. Были проведены измерения уровня глюкозы в крови и биохимические тесты для оценки терапевтического воздействия DNJ на гипергликемию и изучены соответствующие молекулярные механизмы в скелетных мышцах. Введение DNJ значительно снижало массу тела, уровень глюкозы в крови и сывороточного инсулина. Среди эффектов DNJ также наблюдалось увеличение толерантности к глюкозе и инсулину. Более того, хотя экспрессия суммарной протеинкиназы B (AKT), фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K), бета-субъединицы рецептора инсулина (IR-β), субстрата рецептора инсулина-1 (IRS1) и транспортера глюкозы 4 (GLUT4) в скелетных мышцах не была затронута, транслокация GLUT4 и фосфорилирование Ser473-AKT, p85-субъединицы PI3K, Tyr1361-IR-β и Tyr612-IRS1 значительно усиливались при обработке DNJ. Эти результаты указывают на то, что DNJ значительно повышает чувствительность к инсулину за счет активации инсулин-регулируемого сигнального пути PI3K/AKT в скелетных мышцах мышей db/db.
1. ВВЕДЕНИЕ
Сахарный диабет 2 типа, четвертая из основных причин смертности во всем мире, является хроническим нарушением метаболизма. Заболевание характеризуется нарушением гомеостаза липидного и углеводного обмена, и в конечном итоге приводит к инсулинорезистентности и последующей гипергликемии [1]. Также сахарный диабет 2 типа приводит к ряду долгосрочных осложнений, таких как ретинопатия, нефропатия, невропатия, гипертония, атеросклероз и гиперлипидемия [2-4]. В 2011 году от него пострадали около 366 миллионов человек, и ожидается, что в 2035 году это число увеличится до 600 миллионов [5-7]. Сахарный диабет 2 типа характеризуется потерей восприимчивости к инсулину, поэтому повышение резистентности к инсулину является эффективной стратегией лечения заболевания [8]. Традиционная китайская медицина широко использует природные лекарства, и было обнаружено, что различные части лекарственных растений и полученные из них препараты эффективны против диабета.
Шелковица – хорошо известное лиственное дерево, принадлежащее к роду Morus семейства Moraceae. Листья шелковицы широко используются в традиционной китайской медицине в качестве функциональной или медицинской добавки для контроля уровня глюкозы в крови [9-12]. Активными компонентами листьев шелковицы являются флавоноиды, алкалоиды, стероиды и кумарины. Среди этих компонентов антигипергликемический эффект приписывается главным образом алкалоидам, основным соединением которых является 1-дезоксиногиримицин (DNJ).
DNJ представляет собой аналог глюкозы, в структуре которого NH-группа замещает атом кислорода пиранозного кольца (рис. 1). DNJ был впервые выделен из листьев шелковицы (Morus alba) Яги и его коллегами [13]. DNJ обычно рассматривается как конкурентный ингибитор α-глюкозидазы в щетинках тонкого кишечника [14,15,16]. Поэтому рассмотрение терапевтических эффектов DNJ всегда фокусируется на его постпрандиальном гипогликемическом эффекте в желудочно-кишечном тракте. Биологическая активность DNJ в пищеварительном тракте (ингибирование α-глюкозидазы) была всесторонне исследована, однако другие эффекты DNJ не были взяты в рассмотрение. Ким и др. сообщали, что DNJ может всасываться в плазму в интактном виде и достигает максимальной концентрации через 30 мин после перорального приема [17]. Это побудило нас исследовать, оказывает ли DNJ противодиабетический эффект за счет повышения чувствительности к инсулину.
https://drive.google.com/file/d/1SZKEJVph9RtsqKkICXrCh-TGH3UXlAOB/view?usp=share_link
Рис. 1. Структура 1-дезоксиногиримицина
Скелетные мышцы являются основным и крупнейшим местом утилизации глюкозы при стимуляции инсулином [18,19,20,21,22]. В норме инсулин способен снизить уровень глюкозы в крови, способствуя усвоению глюкозы скелетными мышцами. Однако при инсулинорезистентности стимулируемая инсулином утилизация глюкозы в скелетных мышцах серьезно нарушается, поскольку этот орган не реагирует на инсулин должным образом. Это приводит к сбоям функционирования инсулин-регулируемых сигнальных путей в мышцах и повышению уровня глюкозы в крови [23,24]. Следовательно, в нашем исследовании мы выбрали скелетные мышцы для изучения механизма, посредством которого DNJ снижает резистентность к инсулину.
Таким образом, настоящее исследование имело своей целью выяснить, способен ли DNJ повысить чувствительность к инсулину. Для этого DNJ внутривенно вводили мышам db/db, надежной животной модели диабета 2 типа, чтобы исследовать эффекты соединения и связанные с ними механизмы в скелетных мышцах.
2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В настоящем исследовании мы разработали экономичный метод получения больших количеств DNJ. Затем мы исследовали его противодиабетические эффекты на мышах db/db. Мы обнаружили, что DNJ может улучшить состояние при диабете 2 типа за счет снижения резистентности к инсулину. Кроме того, мы исследовали соответствующие молекулярные механизмы в скелетных мышцах.
2.1. Получение DNJ
DNJ считается основным антигипергликемическим компонентом листьев шелковицы. Однако содержание DNJ в листьях растения весьма низкое (около 0,1%), и получение соединения сопряжено с большими сложностями [12,25]. В силу этих обстоятельств, исследования in vivo ограничиваются высокой стоимостью DNJ. Поэтому в данном исследовании мы разработали экономичный метод получения DNJ в больших количествах.
Как показано на рис. 2, первоначально DNJ экстрагировали из высушенных листьев шелковицы кипящей водой. Далее полученный экстракт последовательно очищали на катионообменной смоле, анионообменной смоле и силикагеле H. Окончательно DNJ был выделен после кристаллизации в 95% этаноле. Наличие DNJ в препарате после каждой стадии очистки подтверждали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с флуоресцентным детектором. Препарат после очистки на силикагеле Н имел более высокую чистоту, чем после очистки только на ионообменных смолах. После всех хроматографических стадий выход DNJ составил более 50%. Выделенный препарат подвергали финальной кристаллизации в 95% этаноле, после чего чистота DNJ составила более 95%. Хотя окончательный выход после перекристаллизации составлял всего 30%, данный метод оказался весьма экономичным, а чистота – достаточной для дальнейших целей. Катионообменная смола зачастую использовалась ранее при очистке алкалоидов, к примеру, Ван и др. использовали 732 смолы для отделения DNJ от прочих компонентов из экстрактов листьев шелковицы. Однако чистота DNJ в конечном продукте составила всего 15,3% [26]. В данном исследовании мы дополнительно использовали силикагель H для очистки DNJ и успешно кристаллизовали препарат в 95% этаноле. Этот способ позволил экономично получить большое количество DNJ.
https://drive.google.com/file/d/12FzXbZBEkCNLkVJ-IuCiFQP0rrPyjWmw/view?usp=share_link
Рис. 2. Этапы получения DNJ. Высушенные листья шелковицы (A) экстрагировали кипящей водой, очищали на катионообменной и анионообменной смолах (B); очищали на силикагеле H (C); и далее кристаллизовали в 95% этаноле (D); (E–H) хроматограммы стандарта DNJ (E); образец после очистки на ионообменных смолах (F); на силикагеле H (G); и конечный препарат (H). DNJ подвергали реакции с флуоренилметоксикарбонилхлоридом (FMOC-Cl) с образованием производного DNJ–FMOC, которое детектировали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуоресцентным детектором (ВЭЖХ-FLD).
2.2. Влияние DNJ на массу тела, среднее потребление пищи, потребление воды и выделение мочи
Массу тела, среднее потребление пищи, потребление воды и диурез контролировали один раз в неделю в течение экспериментального периода. Все перечисленные показатели у мышей контрольной группы D (диабетический контроль) были значительно выше, чем у мышей контрольной группы N (нормальный контроль). Как следует из рис. 3А, при отсутствии существенной разницы на первой неделе (11-я неделя) введения DNJ, масса тела мышей db/db, получавших DNJ, значительно снизилась дозозависимым образом по сравнению с контролем D со второй недели (12-я неделя) введения DNJ. Среднее потребление пищи, воды и диурез мышей db/db, получавших DNJ, также были снижены по сравнению с контрольной группой D (рис. 3B–D).
https://drive.google.com/file/d/1eQumcIYMwbNSAa78mT5_xIkz2dGjs4cQ/view?usp=share_link
Рис. 3. Влияние DNJ на массу тела (A); среднее потребление пищи (B); потребление воды (C); и диурез у мышей db/db. Контрольным мышам либо мышам db/db в течение четырех недель внутривенно вводили физиологический раствор либо DNJ. ## р < 0,01 по сравнению с N ( нормальный контроль); * р < 0,05, ** р < 0,01 по сравнению с D (диабетический контроль); @@ р < 0,01 по сравнению с DNJ 20 мг·кг-1·день-1 (n = 6).
Что касается роли DNJ в контроле веса, Конг и др. сообщили об эффекте DNJ против ожирения у крыс Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty (OLETF) [27]. Bacillus subtilis MORI-ферментированный экстракт сои, содержащий DNJ, также снижал массу тела в силу влияния на метаболизм липидов у мышей db/db [28]. В нашем исследовании введение DNJ значительно снижало массу тела у мышей db/db дозозависимым образом. Мыши db/db являются животной моделью диабета 2 типа, ассоциированного с ожирением, которое отчетливо проявляется у этих животных с раннего возраста [29]. Примечательно, что наличие данного состояния синергически увеличивает риск развития диабета 2 типа [30]. Страдающие ожирением и избыточным весом индивиды более склонны к развитию инсулинорезистентности, поэтому снижение веса может помочь в лечении диабета 2 типа.
2.3. DNJ защищает мышей db/db от развития диабета 2 типа
Как видно из рис. 4А, у мышей db/db установился стабильно высокий уровень глюкозы в крови. Введение DNJ значительно снижало уровни глюкозы в крови дозозависимым образом с 11-й недели по сравнению с контрольной диабетической группой D. Кроме того, уровень инсулина в сыворотке крови мышей db/db оказался выше, чем у N (нормальных) контрольных мышей. Инсулин играет решающую роль в поддержании нормальной концентрации глюкозы в крови. Однако в состоянии инсулинорезистентности инсулин не способен эффективно поддерживать усвоение и утилизацию глюкозы. Поэтому при данном нарушении секреция инсулина чрезмерно усиливается для компенсации дисбаланса гомеостаза глюкозы в крови [31]. Введение DNJ (40 и 80 мг·кг-1·день-1) значительно снижало уровень инсулина в сыворотке крови (рис. 4B). Более того, индекс инсулинорезистентности (HOMA-IR), параметр для оценки степени инсулинорезистентности, был заметно повышен у мышей контрольной диабетической группы D (рис. 4C), и значительно изменился дозозависимым образом после введения DNJ в течение четырех недель.
Сообщалось, что DNJ улучшает состояние при диабете за счет ингибирования активности α-глюкозидазы и всасывания глюкозы в щетинках тонкого кишечника [32,33]. Было показано, что DNJ улучшает гликемический контроль у мышей с аллоксан-индуцированным диабетом, а также у крыс со стрептозоцин-индуцированным диабетом [34,35]. Конг и др. сообщали, что DNJ может повысить резистентность к инсулину и/или чувствительность к инсулину у крыс OLETF [27]. Здесь мы впервые продемонстрировали, что DNJ повышает резистентность к инсулину у мышей db/db. В нашем исследовании введение DNJ значительно снижало уровень глюкозы в крови, сывороточный уровень инсулина и индекс HOMA-IR. Эти результаты показали, что DNJ оказывает значительное терапевтическое действие против диабета 2 типа, снижая резистентность к инсулину.
https://drive.google.com/file/d/1e0HDakEJvjOxgfFnONXIhNJ7yzQqG8Pr/view?usp=share_link
Рис. 4. Антидиабетический эффект DNJ у мышей db/db. Были определены уровень глюкозы в крови (A) и сывороточный инсулин (B), а также был рассчитан индекс HOMA-IR (C). ## p < 0,01 по сравнению с N (нормальный контроль); * p < 0,05, ** p < 0,01 по сравнению с D (диабетический контроль); @@ p < 0,01 по сравнению с DNJ 20 мг·кг-1·день-1; $ p < 0,05, $$ p < 0,01 по сравнению с DNJ 40 мг·кг-1·день-1 (n = 6).
2.4. Влияние DNJ на IPGTT (внутрибрюшинный тест на толерантность к глюкозе) и IPITT (внутрибрюшинный тест на толерантность к инсулину)
Тесты на толерантность к глюкозе и инсулину были проведены с учетом особенностей диабета 2 типа, таких как непереносимость глюкозы и инсулинорезистентность [31]. Как представлено на рис. 5A, B, толерантность к глюкозе была охарактеризована с помощью внутрибрюшинного теста на толерантность к глюкозе. Нарушение толерантности к глюкозе, выявленное у мышей db/db, было скорректировано дозозависимым образом при введении DNJ. Аналогично, площадь под кривой (AUC) зависимости концентрации глюкозы в крови от времени была значительно уменьшена дозозависимым образом по сравнению с диабетическим контролем D. Что касается IPITT, то у мышей db/db также наблюдалась непереносимость инсулина, которая была устранена введением DNJ (рис. 5C, D) дозозависимым образом.
Сообщалось, что введение DNJ показало значительное улучшение толерантности к глюкозе у крыс OLETF [27]. Ли и др. сообщали, что DNJ может повысить толерантность к глюкозе у мышей с аллоксан-индуцированным диабетом [34]. В данном исследовании результаты IPGTT и IPITT показали значительное улучшение толерантности к глюкозе и инсулину в ответ на DNJ. В сочетании со снижением массы тела, уровня глюкозы в крови и уровня инсулина в сыворотке крови эти результаты четко указывают на повышение резистентности к инсулину и/или чувствительности к инсулину у мышей db/db, получавших DNJ.
https://drive.google.com/file/d/1Jp8ThWQYbiv8C_x8BE9iiQm97BoUVIOy/view?usp=share_link
Рис. 5. Внутрибрюшинный тест на толерантность к глюкозе (IPGTT) (A), внутрибрюшинный тест на толерантность к инсулину (IPITT) (C), и расчеты площадей под кривыми (AUC) уровней IPGTT (B) и IPITT (D). ## p < 0,01 по сравнению с N (нормальный контроль); ** p < 0,01 по сравнению с D (диабетический контроль); @ p < 0,05, @@ p < 0,01 по сравнению с DNJ 20 мг·кг-1·день-1; $ p < 0,05, $$ p < 0,01 по сравнению с DNJ 40 мг·кг-1·день-1 (n = 6).
Более высокие дозы DNJ (40 и 80 мг·кг-1·день-1) оказывают существенный терапевтический эффект. Для достижения этих концентраций потребовались бы сотни граммов листьев шелковицы в день, поскольку содержание DNJ в них весьма низкое. Однако этих концентраций можно легко достичь с помощью диеты, содержащей DNJ или алкалоиды, экстрагированные из листьев шелковицы.
2.5. Влияние DNJ на экспрессию и транслокацию транспортера глюкозы GLUT4
Транспортеры глюкозы играют важную роль в регуляции уровня глюкозы в крови. Транспортер глюкозы 4 (GLUT4) был тканеспецифично экспрессирован в скелетных мышцах и жировой ткани, где поглощал глюкозу для уменьшения гипергликемии [36].
Чтобы понять, снижает ли DNJ уровень глюкозы в крови за счет повышения экспрессии суммарного белка GLUT4 либо усиления транслокации GLUT4 (m-GLUT4), мы проанализировали уровни экспрессии суммарного GLUT4 и m-GLUT4 в скелетных мышцах методом вестерн-блоттинга. Как представлено на рис. 6, существенных различий в содержании общего белка GLUT4 между мышами нормальной контрольной группы (N) и мышами контрольной диабетической группы (D) не наблюдалось. Однако содержание белка m-GLUT4 у мышей db/db резко снизилось. Эти результаты согласуются с исследованием, в котором сообщалось, что экспрессия суммарного белка GLUT4 не менялась между инсулинорезистентными и контрольными группами мышей [37]. В то же время, у мышей db/db, получавших DNJ, экспрессия m-GLUT4 была выше (почти в три раза), чем у D-контроля (р < 0,01).
Ли с соавт. доказали, что снижение транслокации GLUT4 в эпидидимальных скелетных мышцах повышает уровень глюкозы в крови мышей ob/ob с ожирением, страдающих диабетом [38]. Сообщалось также, что усиленная транслокация GLUT4 подавляла гипергликемию у крыс GK с диабетом 2 типа и мышей KKAy [39]. В этом исследовании наши результаты показали, что DNJ снижает гипергликемию за счет стимулирования транслокации GLUT4 в плазматическую мембрану, но не за счет повышения концентрации общего GLUT4.
https://drive.google.com/file/d/1OkvZMWx1XyH7hoh2KaGJuVrgtdqwR0WP/view?usp=share_link
Рис 6. Влияние DNJ на экспрессию GLUT4 и его транслокацию у мышей db/db. Вестерн-блот-анализ уровней экспрессии GLUT4 и m-GLUT4 в скелетных мышцах мышей db/db (А). Соотношение уровней экспрессии GLUT4 (B) и m-GLUT4 (C). Данные являлись воспроизводимыми для трех независимых экспериментов. GLUT4 был нормализован на содержание β-актина, m-GLUT4 был нормализован на содержание Na+K+-АТФазы α1. ## p < 0,01 по сравнению с N (нормальный контроль); * p < 0,05, ** p < 0,01 по сравнению с D (диабетический контроль); @@ p < 0,01 по сравнению с DNJ 20 мг·кг-1·день-1; $ p < 0,05 по сравнению с DNJ 40 мг·кг-1·день-1 (n = 3).
2.6. DNJ-регулируемое фосфорилирование AKT, PI3K, IR-β и IRS1
Инсулин способствует усвоению глюкозы путем активации ряда сигнальных каскадов, инициируемых связыванием гормона. В этих сигнальных путях связывание инсулина с рецептором инсулина (IR) активирует фосфорилирование домена тирозинкиназы, за которым следует фосфорилирование остатков тирозина субстрата рецептора инсулина (IRS). Фосфорилированный IRS взаимодействует с регуляторной субъединицей p85 фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K). Это приводит к активации фермента и фосфорилированию киназы Ser473-AKT, которая затем, в свою очередь, путем фосфорилирования активирует транслокацию GLUT4-содержащих везикул в плазматическую мембрану и, в конечном итоге, индуцирует усиление транспорта глюкозы [40,41,42,43,44,45,46]. Следовательно, поскольку стимулируемая инсулином транслокация GLUT4 усиливалась при введении DNJ мышам db/db, мы оценили уровень экспрессии общих AKT, PI3K, IR-β и IRS1, а также степень фосфорилирования данных белков, являющихся основными регуляторами транслокации GLUT4, в скелетных мышцах мышей db/db.
Как следует из рис. 7A, B, существенных различий в содержании общего белка AKT и PI3K между группами N-контрольных и D-контрольных мышей не наблюдалось. Фосфорилирование AKT и PI3K оказалось снижено в скелетных мышцах мышей D-контроля по сравнению с нормой. В то же время, фосфорилирование AKT и PI3K значительно усиливалось при введении DNJ по сравнению с контрольной диабетической группой D. Учитывая данный эффект, далее мы исследовали общее фосфорилирование и фосфорилирование остатков тирозина IR-β и IRS1, последовательно активирующее PI3K и AKT. Общее содержание IR-β и IRS1 оставалось неизменным между N-контрольными и D-контрольными мышами, а фосфорилирование IR-β и IRS1 в скелетных мышцах D-контрольных мышей снижалось по сравнению с нормальными мышами. При этом, обработка DNJ значительно усилила фосфорилирование IR-β и IRS1 (рис. 7 C, D). Эти результаты отчетливо показывают, что DNJ стимулирует транслокацию GLUT4 в плазматическую мембрану посредством усиления фосфорилирования IR-β, IRS1, AKT и PI3K, но не повышает уровни экспрессии общих IR-β, IRS1, AKT и PI3K.
https://drive.google.com/file/d/1OkvZMWx1XyH7hoh2KaGJuVrgtdqwR0WP/view?usp=share_link
Рис. 7. Влияние DNJ на экспрессию AKT, PI3K, IR-β и IRS1 и их фосфорилирование у мышей db/db. Вестерн-блот-анализ содержания p-AKT и AKT (A); p-PI3K и PI3K (B); p-IR-β и IR-β (C); и p-IRS1 и IRS1 (D) в скелетных мышцах мышей db/db. Данные являлись воспроизводимыми для трех независимых экспериментов. Содержание всех исследованных белков было нормализовано на содержание β-актина. ## p < 0,01 по сравнению с N (нормальный контроль); * p < 0.05, ** p < 0.01 по сравнению с D (диабетический контроль); @ p < 0.05, @@ p < 0.01 по сравнению с DNJ 20 мг·кг-1·день-1; $ p < 0.05, $$ p < 0.01 по сравнению с DNJ 40 мг·кг-1·день-1 (n = 3).
В норме уровень глюкозы в крови контролируется посредством инсулина, что способствует нормальному усвоению глюкозы, главным образом, жировой тканью и скелетными мышцами. Однако в состоянии инсулинорезистентности скелетные мышцы не реагируют на инсулин должным образом, что приводит к активному усилению секреции инсулина β-клетками поджелудочной железы и последующей гипергликемии [47]. Фосфорилирование Tyr1361-IR-β и Tyr612-IRS1 снижалось в скелетных мышцах мышей с гипергликемией, вызванной соответствующей диетой, но суммарное содержание данных белков оставалось неизменным [48]. При этом, путь PI3K/AKT не активировался инсулином в степени, соответствующей нормальным условиям [45]. Эти данные согласуются с результатами настоящего исследования. Усиление фосфорилирования AKT в скелетных мышцах значительно снижало гипергликемию и инсулинорезистентность у мышей с диабетом 2 типа [49]. Следовательно, роль фосфорилирования IR-β, IRS1, PI3K и AKT в сигнальных путях крайне важна для противостояния гипергликемии и поддержания чувствительности к инсулину. В данном исследовании уровни экспрессии общего IR-β, IRS1, PI3K и AKT не менялись, однако индуцируемое инсулином фосфорилирование Tyr1361-IR-β, Tyr612-IRS1, p85-PI3K и Ser473-AKT усиливалось при введении DNJ в скелетных мышцах мышей db/db. Эти результаты продемонстрировали, что DNJ повышает чувствительность к инсулину за счет усиления фосфорилирования IR-β и IRS1. Это событие впоследствии стимулирует фосфорилирование PI3K, AKT и, наконец, транслокацию GLUT4 в скелетных мышцах мышей db/db.
Таким образом, масса тела, уровень глюкозы в крови, уровень инсулина в сыворотке крови и индекс HOMA-IR у мышей db/db, получавших DNJ, значительно снизились по сравнению с мышами db/db, получавшими обычный физиологический раствор. Кроме того, у мышей db/db, получавших DNJ, значительно повышались толерантность к глюкозе и чувствительность к инсулину. Более того, при введении DNJ были восстановлены ухудшение транслокации GLUT4 и фосфорилирования IR-β, IRS, PI3K и AKT в скелетных мышцах мышей db/db.
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Доступна здесь: https://docs.google.com/document/d/1Ujf7EYcIYSI1TuipCMGecprUit7A8sNk/edit?usp=share_link&ouid=116045022954959817060&rtpof=true&sd=true
4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В данном исследовании был разработан экономичный метод получения больших количеств DNJ. Данные, представленные в этой работе, продемонстрировали, что DNJ снижает гипергликемию за счет повышения чувствительности к инсулину посредством активации инсулин-регулируемого сигнального пути PI3K/AKT в скелетных мышцах мышей db/db. В течение последних десятилетий DNJ рассматривался в качестве ингибитора α-гликозидазы. Однако наше настоящее исследование предоставило убедительные доказательства того, что DNJ подавляет гипергликемию за счет повышения чувствительности к инсулину в скелетных мышцах мышей db/db.
БЛАГОДАРНОСТИ
Авторы выражают свою благодарность за финансирование со стороны Инновационной программы Цзянсу для высшего образования (номер проекта: KYLX_0979), Фонда естественных наук провинции Цзянсу (грант № BK20151005) и Национального фонда естественных наук Китая (81001626).
ВКЛАД АВТОРОВ
G.P., Q.L., X.L. и Y.Z. принадлежит идея и разработка исследования. Q.L. и X.L. проводили эксперименты. Q.L., X.L. C.L. и G.P. проанализировали данные исследования и составили рукопись.
КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ПРИЛОЖЕНИЕ
https://drive.google.com/file/d/11zjm7Bxs2OCap_uk298q5rt4g9_sIL6k/view?usp=share_link
Рис. A1. Влияние алкалоидов (содержание DNJ 40 мг·кг-1), выделенных из листьев шелковицы, на результаты теста толерантности к глюкозе у мышей ICR. * р < 0,05, ** р < 0,01 по сравнению с контрольной группой (n = 10).
https://drive.google.com/file/d/1KzBjU_YwoLu-YGUeZDNrBa57s-GL-VUV/view?usp=share_link
Рис. A2. Влияние различных доз DNJ (10, 20 и 40 мг·кг-1) на результаты теста толерантности к глюкозе у мышей ICR. ** р < 0,01 по сравнению с контрольной группой (n = 10).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Qingpu Liu, Xuan Li, Cunyu Li, Yunfeng Zheng and Guoping Peng
Molecules, 2015, 20, 21700–21714
https://doi.org/10.3390/molecules201219794
Перевод: Е. Крохмалева Редактура: Н. Готманова
Ключевые слова: листья шелковицы; 1-дезоксиногиримицин; мыши db/db; резистентность к инсулину; инсулин-регулируемый сигнальный путь; скелетные мышцы; PI3K/AKT; транслокация GLUT4
Краткое содержание
1-Дезоксиногиримицин (DNJ) широко используется для лечения сахарного диабета в качестве ингибитора α-глюкозидазы тонкого кишечника. Однако об эффектах данного соединения на повышение восприимчивости к инсулину имеется мало сообщений. Цель настоящего исследования – выяснить, способен ли DNJ снижать гипергликемию за счет повышения чувствительности к инсулину. С этой целью был разработан экономичный метод получения больших количеств DNJ. Далее мышам db/db вводили DNJ внутривенно (20, 40 и 80 мг·кг-1·день-1) в течение четырех недель. Были проведены измерения уровня глюкозы в крови и биохимические тесты для оценки терапевтического воздействия DNJ на гипергликемию и изучены соответствующие молекулярные механизмы в скелетных мышцах. Введение DNJ значительно снижало массу тела, уровень глюкозы в крови и сывороточного инсулина. Среди эффектов DNJ также наблюдалось увеличение толерантности к глюкозе и инсулину. Более того, хотя экспрессия суммарной протеинкиназы B (AKT), фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K), бета-субъединицы рецептора инсулина (IR-β), субстрата рецептора инсулина-1 (IRS1) и транспортера глюкозы 4 (GLUT4) в скелетных мышцах не была затронута, транслокация GLUT4 и фосфорилирование Ser473-AKT, p85-субъединицы PI3K, Tyr1361-IR-β и Tyr612-IRS1 значительно усиливались при обработке DNJ. Эти результаты указывают на то, что DNJ значительно повышает чувствительность к инсулину за счет активации инсулин-регулируемого сигнального пути PI3K/AKT в скелетных мышцах мышей db/db.
1. ВВЕДЕНИЕ
Сахарный диабет 2 типа, четвертая из основных причин смертности во всем мире, является хроническим нарушением метаболизма. Заболевание характеризуется нарушением гомеостаза липидного и углеводного обмена, и в конечном итоге приводит к инсулинорезистентности и последующей гипергликемии [1]. Также сахарный диабет 2 типа приводит к ряду долгосрочных осложнений, таких как ретинопатия, нефропатия, невропатия, гипертония, атеросклероз и гиперлипидемия [2-4]. В 2011 году от него пострадали около 366 миллионов человек, и ожидается, что в 2035 году это число увеличится до 600 миллионов [5-7]. Сахарный диабет 2 типа характеризуется потерей восприимчивости к инсулину, поэтому повышение резистентности к инсулину является эффективной стратегией лечения заболевания [8]. Традиционная китайская медицина широко использует природные лекарства, и было обнаружено, что различные части лекарственных растений и полученные из них препараты эффективны против диабета.
Шелковица – хорошо известное лиственное дерево, принадлежащее к роду Morus семейства Moraceae. Листья шелковицы широко используются в традиционной китайской медицине в качестве функциональной или медицинской добавки для контроля уровня глюкозы в крови [9-12]. Активными компонентами листьев шелковицы являются флавоноиды, алкалоиды, стероиды и кумарины. Среди этих компонентов антигипергликемический эффект приписывается главным образом алкалоидам, основным соединением которых является 1-дезоксиногиримицин (DNJ).
DNJ представляет собой аналог глюкозы, в структуре которого NH-группа замещает атом кислорода пиранозного кольца (рис. 1). DNJ был впервые выделен из листьев шелковицы (Morus alba) Яги и его коллегами [13]. DNJ обычно рассматривается как конкурентный ингибитор α-глюкозидазы в щетинках тонкого кишечника [14,15,16]. Поэтому рассмотрение терапевтических эффектов DNJ всегда фокусируется на его постпрандиальном гипогликемическом эффекте в желудочно-кишечном тракте. Биологическая активность DNJ в пищеварительном тракте (ингибирование α-глюкозидазы) была всесторонне исследована, однако другие эффекты DNJ не были взяты в рассмотрение. Ким и др. сообщали, что DNJ может всасываться в плазму в интактном виде и достигает максимальной концентрации через 30 мин после перорального приема [17]. Это побудило нас исследовать, оказывает ли DNJ противодиабетический эффект за счет повышения чувствительности к инсулину.
https://drive.google.com/file/d/1SZKEJVph9RtsqKkICXrCh-TGH3UXlAOB/view?usp=share_link
Рис. 1. Структура 1-дезоксиногиримицина
Скелетные мышцы являются основным и крупнейшим местом утилизации глюкозы при стимуляции инсулином [18,19,20,21,22]. В норме инсулин способен снизить уровень глюкозы в крови, способствуя усвоению глюкозы скелетными мышцами. Однако при инсулинорезистентности стимулируемая инсулином утилизация глюкозы в скелетных мышцах серьезно нарушается, поскольку этот орган не реагирует на инсулин должным образом. Это приводит к сбоям функционирования инсулин-регулируемых сигнальных путей в мышцах и повышению уровня глюкозы в крови [23,24]. Следовательно, в нашем исследовании мы выбрали скелетные мышцы для изучения механизма, посредством которого DNJ снижает резистентность к инсулину.
Таким образом, настоящее исследование имело своей целью выяснить, способен ли DNJ повысить чувствительность к инсулину. Для этого DNJ внутривенно вводили мышам db/db, надежной животной модели диабета 2 типа, чтобы исследовать эффекты соединения и связанные с ними механизмы в скелетных мышцах.
2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В настоящем исследовании мы разработали экономичный метод получения больших количеств DNJ. Затем мы исследовали его противодиабетические эффекты на мышах db/db. Мы обнаружили, что DNJ может улучшить состояние при диабете 2 типа за счет снижения резистентности к инсулину. Кроме того, мы исследовали соответствующие молекулярные механизмы в скелетных мышцах.
2.1. Получение DNJ
DNJ считается основным антигипергликемическим компонентом листьев шелковицы. Однако содержание DNJ в листьях растения весьма низкое (около 0,1%), и получение соединения сопряжено с большими сложностями [12,25]. В силу этих обстоятельств, исследования in vivo ограничиваются высокой стоимостью DNJ. Поэтому в данном исследовании мы разработали экономичный метод получения DNJ в больших количествах.
Как показано на рис. 2, первоначально DNJ экстрагировали из высушенных листьев шелковицы кипящей водой. Далее полученный экстракт последовательно очищали на катионообменной смоле, анионообменной смоле и силикагеле H. Окончательно DNJ был выделен после кристаллизации в 95% этаноле. Наличие DNJ в препарате после каждой стадии очистки подтверждали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с флуоресцентным детектором. Препарат после очистки на силикагеле Н имел более высокую чистоту, чем после очистки только на ионообменных смолах. После всех хроматографических стадий выход DNJ составил более 50%. Выделенный препарат подвергали финальной кристаллизации в 95% этаноле, после чего чистота DNJ составила более 95%. Хотя окончательный выход после перекристаллизации составлял всего 30%, данный метод оказался весьма экономичным, а чистота – достаточной для дальнейших целей. Катионообменная смола зачастую использовалась ранее при очистке алкалоидов, к примеру, Ван и др. использовали 732 смолы для отделения DNJ от прочих компонентов из экстрактов листьев шелковицы. Однако чистота DNJ в конечном продукте составила всего 15,3% [26]. В данном исследовании мы дополнительно использовали силикагель H для очистки DNJ и успешно кристаллизовали препарат в 95% этаноле. Этот способ позволил экономично получить большое количество DNJ.
https://drive.google.com/file/d/12FzXbZBEkCNLkVJ-IuCiFQP0rrPyjWmw/view?usp=share_link
Рис. 2. Этапы получения DNJ. Высушенные листья шелковицы (A) экстрагировали кипящей водой, очищали на катионообменной и анионообменной смолах (B); очищали на силикагеле H (C); и далее кристаллизовали в 95% этаноле (D); (E–H) хроматограммы стандарта DNJ (E); образец после очистки на ионообменных смолах (F); на силикагеле H (G); и конечный препарат (H). DNJ подвергали реакции с флуоренилметоксикарбонилхлоридом (FMOC-Cl) с образованием производного DNJ–FMOC, которое детектировали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуоресцентным детектором (ВЭЖХ-FLD).
2.2. Влияние DNJ на массу тела, среднее потребление пищи, потребление воды и выделение мочи
Массу тела, среднее потребление пищи, потребление воды и диурез контролировали один раз в неделю в течение экспериментального периода. Все перечисленные показатели у мышей контрольной группы D (диабетический контроль) были значительно выше, чем у мышей контрольной группы N (нормальный контроль). Как следует из рис. 3А, при отсутствии существенной разницы на первой неделе (11-я неделя) введения DNJ, масса тела мышей db/db, получавших DNJ, значительно снизилась дозозависимым образом по сравнению с контролем D со второй недели (12-я неделя) введения DNJ. Среднее потребление пищи, воды и диурез мышей db/db, получавших DNJ, также были снижены по сравнению с контрольной группой D (рис. 3B–D).
https://drive.google.com/file/d/1eQumcIYMwbNSAa78mT5_xIkz2dGjs4cQ/view?usp=share_link
Рис. 3. Влияние DNJ на массу тела (A); среднее потребление пищи (B); потребление воды (C); и диурез у мышей db/db. Контрольным мышам либо мышам db/db в течение четырех недель внутривенно вводили физиологический раствор либо DNJ. ## р < 0,01 по сравнению с N ( нормальный контроль); * р < 0,05, ** р < 0,01 по сравнению с D (диабетический контроль); @@ р < 0,01 по сравнению с DNJ 20 мг·кг-1·день-1 (n = 6).
Что касается роли DNJ в контроле веса, Конг и др. сообщили об эффекте DNJ против ожирения у крыс Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty (OLETF) [27]. Bacillus subtilis MORI-ферментированный экстракт сои, содержащий DNJ, также снижал массу тела в силу влияния на метаболизм липидов у мышей db/db [28]. В нашем исследовании введение DNJ значительно снижало массу тела у мышей db/db дозозависимым образом. Мыши db/db являются животной моделью диабета 2 типа, ассоциированного с ожирением, которое отчетливо проявляется у этих животных с раннего возраста [29]. Примечательно, что наличие данного состояния синергически увеличивает риск развития диабета 2 типа [30]. Страдающие ожирением и избыточным весом индивиды более склонны к развитию инсулинорезистентности, поэтому снижение веса может помочь в лечении диабета 2 типа.
2.3. DNJ защищает мышей db/db от развития диабета 2 типа
Как видно из рис. 4А, у мышей db/db установился стабильно высокий уровень глюкозы в крови. Введение DNJ значительно снижало уровни глюкозы в крови дозозависимым образом с 11-й недели по сравнению с контрольной диабетической группой D. Кроме того, уровень инсулина в сыворотке крови мышей db/db оказался выше, чем у N (нормальных) контрольных мышей. Инсулин играет решающую роль в поддержании нормальной концентрации глюкозы в крови. Однако в состоянии инсулинорезистентности инсулин не способен эффективно поддерживать усвоение и утилизацию глюкозы. Поэтому при данном нарушении секреция инсулина чрезмерно усиливается для компенсации дисбаланса гомеостаза глюкозы в крови [31]. Введение DNJ (40 и 80 мг·кг-1·день-1) значительно снижало уровень инсулина в сыворотке крови (рис. 4B). Более того, индекс инсулинорезистентности (HOMA-IR), параметр для оценки степени инсулинорезистентности, был заметно повышен у мышей контрольной диабетической группы D (рис. 4C), и значительно изменился дозозависимым образом после введения DNJ в течение четырех недель.
Сообщалось, что DNJ улучшает состояние при диабете за счет ингибирования активности α-глюкозидазы и всасывания глюкозы в щетинках тонкого кишечника [32,33]. Было показано, что DNJ улучшает гликемический контроль у мышей с аллоксан-индуцированным диабетом, а также у крыс со стрептозоцин-индуцированным диабетом [34,35]. Конг и др. сообщали, что DNJ может повысить резистентность к инсулину и/или чувствительность к инсулину у крыс OLETF [27]. Здесь мы впервые продемонстрировали, что DNJ повышает резистентность к инсулину у мышей db/db. В нашем исследовании введение DNJ значительно снижало уровень глюкозы в крови, сывороточный уровень инсулина и индекс HOMA-IR. Эти результаты показали, что DNJ оказывает значительное терапевтическое действие против диабета 2 типа, снижая резистентность к инсулину.
https://drive.google.com/file/d/1e0HDakEJvjOxgfFnONXIhNJ7yzQqG8Pr/view?usp=share_link
Рис. 4. Антидиабетический эффект DNJ у мышей db/db. Были определены уровень глюкозы в крови (A) и сывороточный инсулин (B), а также был рассчитан индекс HOMA-IR (C). ## p < 0,01 по сравнению с N (нормальный контроль); * p < 0,05, ** p < 0,01 по сравнению с D (диабетический контроль); @@ p < 0,01 по сравнению с DNJ 20 мг·кг-1·день-1; $ p < 0,05, $$ p < 0,01 по сравнению с DNJ 40 мг·кг-1·день-1 (n = 6).
2.4. Влияние DNJ на IPGTT (внутрибрюшинный тест на толерантность к глюкозе) и IPITT (внутрибрюшинный тест на толерантность к инсулину)
Тесты на толерантность к глюкозе и инсулину были проведены с учетом особенностей диабета 2 типа, таких как непереносимость глюкозы и инсулинорезистентность [31]. Как представлено на рис. 5A, B, толерантность к глюкозе была охарактеризована с помощью внутрибрюшинного теста на толерантность к глюкозе. Нарушение толерантности к глюкозе, выявленное у мышей db/db, было скорректировано дозозависимым образом при введении DNJ. Аналогично, площадь под кривой (AUC) зависимости концентрации глюкозы в крови от времени была значительно уменьшена дозозависимым образом по сравнению с диабетическим контролем D. Что касается IPITT, то у мышей db/db также наблюдалась непереносимость инсулина, которая была устранена введением DNJ (рис. 5C, D) дозозависимым образом.
Сообщалось, что введение DNJ показало значительное улучшение толерантности к глюкозе у крыс OLETF [27]. Ли и др. сообщали, что DNJ может повысить толерантность к глюкозе у мышей с аллоксан-индуцированным диабетом [34]. В данном исследовании результаты IPGTT и IPITT показали значительное улучшение толерантности к глюкозе и инсулину в ответ на DNJ. В сочетании со снижением массы тела, уровня глюкозы в крови и уровня инсулина в сыворотке крови эти результаты четко указывают на повышение резистентности к инсулину и/или чувствительности к инсулину у мышей db/db, получавших DNJ.
https://drive.google.com/file/d/1Jp8ThWQYbiv8C_x8BE9iiQm97BoUVIOy/view?usp=share_link
Рис. 5. Внутрибрюшинный тест на толерантность к глюкозе (IPGTT) (A), внутрибрюшинный тест на толерантность к инсулину (IPITT) (C), и расчеты площадей под кривыми (AUC) уровней IPGTT (B) и IPITT (D). ## p < 0,01 по сравнению с N (нормальный контроль); ** p < 0,01 по сравнению с D (диабетический контроль); @ p < 0,05, @@ p < 0,01 по сравнению с DNJ 20 мг·кг-1·день-1; $ p < 0,05, $$ p < 0,01 по сравнению с DNJ 40 мг·кг-1·день-1 (n = 6).
Более высокие дозы DNJ (40 и 80 мг·кг-1·день-1) оказывают существенный терапевтический эффект. Для достижения этих концентраций потребовались бы сотни граммов листьев шелковицы в день, поскольку содержание DNJ в них весьма низкое. Однако этих концентраций можно легко достичь с помощью диеты, содержащей DNJ или алкалоиды, экстрагированные из листьев шелковицы.
2.5. Влияние DNJ на экспрессию и транслокацию транспортера глюкозы GLUT4
Транспортеры глюкозы играют важную роль в регуляции уровня глюкозы в крови. Транспортер глюкозы 4 (GLUT4) был тканеспецифично экспрессирован в скелетных мышцах и жировой ткани, где поглощал глюкозу для уменьшения гипергликемии [36].
Чтобы понять, снижает ли DNJ уровень глюкозы в крови за счет повышения экспрессии суммарного белка GLUT4 либо усиления транслокации GLUT4 (m-GLUT4), мы проанализировали уровни экспрессии суммарного GLUT4 и m-GLUT4 в скелетных мышцах методом вестерн-блоттинга. Как представлено на рис. 6, существенных различий в содержании общего белка GLUT4 между мышами нормальной контрольной группы (N) и мышами контрольной диабетической группы (D) не наблюдалось. Однако содержание белка m-GLUT4 у мышей db/db резко снизилось. Эти результаты согласуются с исследованием, в котором сообщалось, что экспрессия суммарного белка GLUT4 не менялась между инсулинорезистентными и контрольными группами мышей [37]. В то же время, у мышей db/db, получавших DNJ, экспрессия m-GLUT4 была выше (почти в три раза), чем у D-контроля (р < 0,01).
Ли с соавт. доказали, что снижение транслокации GLUT4 в эпидидимальных скелетных мышцах повышает уровень глюкозы в крови мышей ob/ob с ожирением, страдающих диабетом [38]. Сообщалось также, что усиленная транслокация GLUT4 подавляла гипергликемию у крыс GK с диабетом 2 типа и мышей KKAy [39]. В этом исследовании наши результаты показали, что DNJ снижает гипергликемию за счет стимулирования транслокации GLUT4 в плазматическую мембрану, но не за счет повышения концентрации общего GLUT4.
https://drive.google.com/file/d/1OkvZMWx1XyH7hoh2KaGJuVrgtdqwR0WP/view?usp=share_link
Рис 6. Влияние DNJ на экспрессию GLUT4 и его транслокацию у мышей db/db. Вестерн-блот-анализ уровней экспрессии GLUT4 и m-GLUT4 в скелетных мышцах мышей db/db (А). Соотношение уровней экспрессии GLUT4 (B) и m-GLUT4 (C). Данные являлись воспроизводимыми для трех независимых экспериментов. GLUT4 был нормализован на содержание β-актина, m-GLUT4 был нормализован на содержание Na+K+-АТФазы α1. ## p < 0,01 по сравнению с N (нормальный контроль); * p < 0,05, ** p < 0,01 по сравнению с D (диабетический контроль); @@ p < 0,01 по сравнению с DNJ 20 мг·кг-1·день-1; $ p < 0,05 по сравнению с DNJ 40 мг·кг-1·день-1 (n = 3).
2.6. DNJ-регулируемое фосфорилирование AKT, PI3K, IR-β и IRS1
Инсулин способствует усвоению глюкозы путем активации ряда сигнальных каскадов, инициируемых связыванием гормона. В этих сигнальных путях связывание инсулина с рецептором инсулина (IR) активирует фосфорилирование домена тирозинкиназы, за которым следует фосфорилирование остатков тирозина субстрата рецептора инсулина (IRS). Фосфорилированный IRS взаимодействует с регуляторной субъединицей p85 фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K). Это приводит к активации фермента и фосфорилированию киназы Ser473-AKT, которая затем, в свою очередь, путем фосфорилирования активирует транслокацию GLUT4-содержащих везикул в плазматическую мембрану и, в конечном итоге, индуцирует усиление транспорта глюкозы [40,41,42,43,44,45,46]. Следовательно, поскольку стимулируемая инсулином транслокация GLUT4 усиливалась при введении DNJ мышам db/db, мы оценили уровень экспрессии общих AKT, PI3K, IR-β и IRS1, а также степень фосфорилирования данных белков, являющихся основными регуляторами транслокации GLUT4, в скелетных мышцах мышей db/db.
Как следует из рис. 7A, B, существенных различий в содержании общего белка AKT и PI3K между группами N-контрольных и D-контрольных мышей не наблюдалось. Фосфорилирование AKT и PI3K оказалось снижено в скелетных мышцах мышей D-контроля по сравнению с нормой. В то же время, фосфорилирование AKT и PI3K значительно усиливалось при введении DNJ по сравнению с контрольной диабетической группой D. Учитывая данный эффект, далее мы исследовали общее фосфорилирование и фосфорилирование остатков тирозина IR-β и IRS1, последовательно активирующее PI3K и AKT. Общее содержание IR-β и IRS1 оставалось неизменным между N-контрольными и D-контрольными мышами, а фосфорилирование IR-β и IRS1 в скелетных мышцах D-контрольных мышей снижалось по сравнению с нормальными мышами. При этом, обработка DNJ значительно усилила фосфорилирование IR-β и IRS1 (рис. 7 C, D). Эти результаты отчетливо показывают, что DNJ стимулирует транслокацию GLUT4 в плазматическую мембрану посредством усиления фосфорилирования IR-β, IRS1, AKT и PI3K, но не повышает уровни экспрессии общих IR-β, IRS1, AKT и PI3K.
https://drive.google.com/file/d/1OkvZMWx1XyH7hoh2KaGJuVrgtdqwR0WP/view?usp=share_link
Рис. 7. Влияние DNJ на экспрессию AKT, PI3K, IR-β и IRS1 и их фосфорилирование у мышей db/db. Вестерн-блот-анализ содержания p-AKT и AKT (A); p-PI3K и PI3K (B); p-IR-β и IR-β (C); и p-IRS1 и IRS1 (D) в скелетных мышцах мышей db/db. Данные являлись воспроизводимыми для трех независимых экспериментов. Содержание всех исследованных белков было нормализовано на содержание β-актина. ## p < 0,01 по сравнению с N (нормальный контроль); * p < 0.05, ** p < 0.01 по сравнению с D (диабетический контроль); @ p < 0.05, @@ p < 0.01 по сравнению с DNJ 20 мг·кг-1·день-1; $ p < 0.05, $$ p < 0.01 по сравнению с DNJ 40 мг·кг-1·день-1 (n = 3).
В норме уровень глюкозы в крови контролируется посредством инсулина, что способствует нормальному усвоению глюкозы, главным образом, жировой тканью и скелетными мышцами. Однако в состоянии инсулинорезистентности скелетные мышцы не реагируют на инсулин должным образом, что приводит к активному усилению секреции инсулина β-клетками поджелудочной железы и последующей гипергликемии [47]. Фосфорилирование Tyr1361-IR-β и Tyr612-IRS1 снижалось в скелетных мышцах мышей с гипергликемией, вызванной соответствующей диетой, но суммарное содержание данных белков оставалось неизменным [48]. При этом, путь PI3K/AKT не активировался инсулином в степени, соответствующей нормальным условиям [45]. Эти данные согласуются с результатами настоящего исследования. Усиление фосфорилирования AKT в скелетных мышцах значительно снижало гипергликемию и инсулинорезистентность у мышей с диабетом 2 типа [49]. Следовательно, роль фосфорилирования IR-β, IRS1, PI3K и AKT в сигнальных путях крайне важна для противостояния гипергликемии и поддержания чувствительности к инсулину. В данном исследовании уровни экспрессии общего IR-β, IRS1, PI3K и AKT не менялись, однако индуцируемое инсулином фосфорилирование Tyr1361-IR-β, Tyr612-IRS1, p85-PI3K и Ser473-AKT усиливалось при введении DNJ в скелетных мышцах мышей db/db. Эти результаты продемонстрировали, что DNJ повышает чувствительность к инсулину за счет усиления фосфорилирования IR-β и IRS1. Это событие впоследствии стимулирует фосфорилирование PI3K, AKT и, наконец, транслокацию GLUT4 в скелетных мышцах мышей db/db.
Таким образом, масса тела, уровень глюкозы в крови, уровень инсулина в сыворотке крови и индекс HOMA-IR у мышей db/db, получавших DNJ, значительно снизились по сравнению с мышами db/db, получавшими обычный физиологический раствор. Кроме того, у мышей db/db, получавших DNJ, значительно повышались толерантность к глюкозе и чувствительность к инсулину. Более того, при введении DNJ были восстановлены ухудшение транслокации GLUT4 и фосфорилирования IR-β, IRS, PI3K и AKT в скелетных мышцах мышей db/db.
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Доступна здесь: https://docs.google.com/document/d/1Ujf7EYcIYSI1TuipCMGecprUit7A8sNk/edit?usp=share_link&ouid=116045022954959817060&rtpof=true&sd=true
4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В данном исследовании был разработан экономичный метод получения больших количеств DNJ. Данные, представленные в этой работе, продемонстрировали, что DNJ снижает гипергликемию за счет повышения чувствительности к инсулину посредством активации инсулин-регулируемого сигнального пути PI3K/AKT в скелетных мышцах мышей db/db. В течение последних десятилетий DNJ рассматривался в качестве ингибитора α-гликозидазы. Однако наше настоящее исследование предоставило убедительные доказательства того, что DNJ подавляет гипергликемию за счет повышения чувствительности к инсулину в скелетных мышцах мышей db/db.
БЛАГОДАРНОСТИ
Авторы выражают свою благодарность за финансирование со стороны Инновационной программы Цзянсу для высшего образования (номер проекта: KYLX_0979), Фонда естественных наук провинции Цзянсу (грант № BK20151005) и Национального фонда естественных наук Китая (81001626).
ВКЛАД АВТОРОВ
G.P., Q.L., X.L. и Y.Z. принадлежит идея и разработка исследования. Q.L. и X.L. проводили эксперименты. Q.L., X.L. C.L. и G.P. проанализировали данные исследования и составили рукопись.
КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ПРИЛОЖЕНИЕ
https://drive.google.com/file/d/11zjm7Bxs2OCap_uk298q5rt4g9_sIL6k/view?usp=share_link
Рис. A1. Влияние алкалоидов (содержание DNJ 40 мг·кг-1), выделенных из листьев шелковицы, на результаты теста толерантности к глюкозе у мышей ICR. * р < 0,05, ** р < 0,01 по сравнению с контрольной группой (n = 10).
https://drive.google.com/file/d/1KzBjU_YwoLu-YGUeZDNrBa57s-GL-VUV/view?usp=share_link
Рис. A2. Влияние различных доз DNJ (10, 20 и 40 мг·кг-1) на результаты теста толерантности к глюкозе у мышей ICR. ** р < 0,01 по сравнению с контрольной группой (n = 10).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Zheng, T.; Shu, G.; Yang, Z.; Mo, S.; Zhao, Y.; Mei, Z. Antidiabetic effect of total saponins from Entada phaseoloides (L.) Merr. in type 2 diabetic rats. J. Ethnopharmacol. 2012, 139, 814–821.
2. Goh, S.Y.; Cooper, M.E. Clinical review: The role of advanced glycation end products in progression and complications of diabetes. J. Clin. Endocrinol. Metab. 2008, 93, 1143–1152.
3. Al-Malki, A.L.; Barbour, E.K.; Abulnaja, K.O.; Moselhy, S.S. Management of hyperglycaemia by ethyl acetate extract of Balanites aegyptiaca (desert date). Molecules 2015, 20, 14425–14434.
4. Beit-Yannai, E.; Ben-Shabat, S.; Goldschmidt, N.; Chapagain, B.P.; Liu, R.H.; Wiesman, Z. Antiproliferative activity of steroidal saponins from Balanites aegyptiaca—An in vitro study. Phytochem. Lett. 2011, 4, 43–47.
5. Whiting, D.R.; Guariquata, L.; Weil, C.; Shaw, J. IDF diabetes atlas: Global estimates of the prevalence of diabetes for 2011 and 2030. Diabetes Res. Clin. Pract. 2011, 94, 311–321.
6. Guariguata, L.; Nolan, T.; Beagley, J.; Linnenkamp, U.; Jacqmain, O. IDF Diabetes Atlas, 6th ed.; International Diabetes Federation: Brussels, Belgium, 2013; p. 160.
7. Bakar, M.H.A.; Sarmidi, M.R.; Cheng, K.K.; Khan, A.A.; Chua, L.S.; Huri, H.Z.; Yaakob, H. Metabolomics—The complementary field in systems biology: A review on obesity and type 2 diabetes. Mol. Biosyst. 2015, 11, 1742–1774.
8. Yamashita, Y.; Wang, L.; Tinshun, Z.; Nakamura, T.; Ashida, H. Fermented tea improves glucose intolerance in mice by enhancing translocation of glucose transporter 4 in skeletal muscle. J. Agric. Food Chem. 2012, 60, 11366–11371.
9. Kooij, R.; Branderhorst, H.M.; Bonte, S.; Wieclawska, S.; Martin, N.I.; Pieters, R.J. Glycosidase inhibition by novel guanidinium and urea iminosugar derivatives. Med. Chem. Comm. 2013, 4, 387–393.
10. Tsuduki, T.; Kikuchi, I.; Kimura, T.; Nakagawa, K.; Miyazawa, T. Intake of mulberry 1-deoxynojirimycin prevents diet-induced obesity through increases in adiponectin in mice. Food Chem. 2013, 139, 16–23.
11. Asano, N.; Yamashita, T.; Yasuda, K.; Ikeda, K.; Kizu, H.; Kameda, Y.; Kato, A.; Nash, R.J.; Lee, H.S.; Ryu, K.S. Polyhydroxylated alkaloids isolated from mulberry trees (Morus alba L.) and silkworms (Bombyx mori L.). J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 4208–4213.
12. Kimura, M.; Chen, F. Antihyperglycemic effects of N-containing sugars derived from mulberry leaves is streptozocin-in-duced diabetic mice. Wakan Iyakugaku Zasshi 1995, 12, 214–219.
13. Yagi, M.; Kouno, T.; Aoyagi, Y.; Murai, H. The structure of moranoline, a peperidine alkaloid from Morus species. Nippon Nogei Kagaku Kaishi 1976, 50, 571–572.
14. Zechel, D.L.; Boraston, A.B.; Gloster, T.; Boraston, C.M.; Macdonald, J.M.; Tilbrook, D.M.; Stick, R.V.; Davies, G.J. Iminosugar glycosidase inhibitors: Structural and thermodynamic dissection of the binding of isofagomine and 1-deoxynojirimycin to β-glucosidases. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 14313–14323.
15. Cheatham, B.; Vlahos, C.J.; Cheatham, L.; Wang, L.; Blenis, J.; Kahn, C.R. Phosphatidylinositol 3-kinase activation is required for insulin stimulation of pp70 S6 kinase, DNA synthesis, and glucose transporter translocation. Mol. Cell Biol. 1994, 14, 4902–4911.
16. Le Marchand-Brustel, Y.; Gautier, N.; Cormont, M.; van Obberghen, E. Wortmannin inhibits the action of insulin but not that of okadaic acid in skeletal muscle: Comparison with fat cells. Endocrinology 1995, 136, 3564–3570.]
17. Nakagawa, K.; Kubota, H.; Kimura, T.; Yamashita, S.; Tsuzuki, T.; Oikawa, S.; Miyazawa, T. Occurrence of orally administered mulberry 1-deoxynojirimycin in rat plasma. J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 8928–8933.
18. Blonde, L. Current antihyperglycemic treatment guidelines and algorithms for patients with type 2 diabetes mellitus. Am. J. Med. 2010, 123, 12–18.
19. DeFronzo, R.A. Pathogenesis of type 2 diabetes: Metabolic and molecular implications for identifying diabetes genes. Diabetes Rev. 1997, 5, 177–269.
20. Lanza, I.R.; Sreekumaran Nair, K. Regulation of skeletal muscle mitochondrial function: Genes to proteins. Acta Physiol. 2010, 199, 529–547.
21. Shulman, G.I.; Rothman, D.L.; Jue, T.; Stein, P.; Defronzo, R.A.; Shulman, R.G. Quantitation of muscle glycogen-synthesis in normal subjects and subjects with non-insulin-dependent diabetes by c-13 nuclear magnetic-resonance spectroscopy. N. Engl. J. Med. 1990, 322, 223–228.
22. Defronzo, R.A.; Jacot, E.; Jequier, E.; Maeder, E.; Wahren, J.; Felber, J.P. The effect of insulin on the disposal of intravenous glucose. Results from indirect calorimetry and hepatic and femoral venous catheterization. Diabetes 1981, 30, 1000–1007.
23. Defronzo, R.A. Pathogenesis of type 2 diabetes mellitus. Med. Clin. N. Am. 2004, 88, 787–835.
24. Defronzo, R.A. Banting Lecture. From the triumvirate to the ominous octet: A new paradigm for the treatment of type 2 diabetes mellitus. Diabetes 2009, 58, 773–795.
25. Akira, A.; Nakaqawa, K.; Hiquchi, O.; Kimura, T.; Kojima, Y.; Kariya, J.; Miyazawa, T.; Oikawa, S. Effect of mulberry leaf extract with enriched 1-deoxynojirimycin content on postprandial glycemic control in subjects with impaired glucose metabolism. J. Diabetes Investig. 2011, 2, 318–323.
26. Wang, T.; Li, C.Q.; Zhang, H.; Li, J.W. Response surface optimized extraction of 1-deoxynojirimycin from mulberry leaves (Morus alba L.) and preparative separation with resins. Molecules 2014, 19, 7040–7056.
27. Kong, W.H.; Oh, S.H.; Ahn, Y.R.; Kim, K.W.; Kim, J.H.; Seo, S.W. Antiobesity effects and improvement of insulin sensitivity by 1-deoxynojirimycin in animal models. J. Agric. Food Chem. 2008, 56, 2613–2619.
28. Nam, Y.; Jung, H.; Karuppasamy, S.; Lee, J.Y.; Kang, K.D.; Hwang, K.Y.; Seong, S.I.; Suh, J.G. Anti-hyperlipidemic effect of soybean extract fermented by Bacillus subtilis MORI in db/db mice. Lab. Anim. Res. 2012, 28, 123–129.
29. Kobayashi, K.; Forte, T.M.; Taniguchi, S.; Ishida, B.Y.; Oka, K.; Chan, L. The db/db mouse, a model for diabetic dyslipidemia: Molecular characterization and effects of Western diet feeding. Metabolism 2000, 49, 22–31.
30. Burra, P. Liver abnormalities and endocrine diseases. Best Pract. Res. Clin. Gastroenterol. 2013, 27, 553–563.
31. Eckel, R.H.; Grundy, S.M.; Zimmet, P.Z. The metabolic syndrome. Lancet 2005, 365, 1415–1428.
32. Kwon, H.J.; Chung, J.Y.; Kim, J.Y.; Kwon, O. Comparison of 1-deoxynojirimycinand aqueous mulberry leaf extract with emphasis on postprandial hypoglycemic effects: In vivo and in vitro studies. J. Agric. Food Chem. 2011, 59, 3014–3019.
33. Li, Y.G.; Ji, D.F.; Zhong, S.; Lv, Z.Q.; Lin, T.B. Cooperative anti-diabetic effects of deoxynojirimycin-polysaccharide by inhibiting glucose absorption and modulating glucose metabolism in streptozotocin-induced diabetic mice. PLoS ONE 2013, 8, e65892.
34. Li, Y.G.; Ji, D.F.; Zhong, S.; Lv, Z.Q.; Lin, T.B.; Chen, S.; Hu, G.Y. Hybrid of 1-deoxynojirimycin and polysaccharide from mulberry leaves treat diabetes mellitus by activating PDX-1/insulin-1 signaling pathway and regulating the expression of glucokinase, phosphoenolpyruvate carboxykinase and glucose-6-phosphatase in alloxan-induced diabetic mice. J. Ethnopharmacol. 2011, 134, 961–970.
35. Li, Y.G.; Ji, D.F.; Zhong, S.; Lin, T.B.; Lv, Z.Q.; Hu, G.Y.; Wang, X. 1-deoxynojirimycin inhibits glucose absorption and accelerates glucose metabolism in streptozotocin-induced diabetic mice. Sci. Rep. 2013, 3, 1377.
36. Benalla, W.; Bellahcen, S.; Bnouham, M. Antidiabetic medicinal plants as a source of α-glucosidase inhibitors. Curr. Diabetes Rev. 2010, 6, 247–254.
37. Kim, S.; Jwa, H.; Yanagawa, Y.; Park, T. Extract from Dioscorea batatas ameliorates insulin resistance in mice fed a high-fat diet. J. Med. Food 2012, 15, 527–534.
38. Lee, Y.S.; Cha, B.Y.; Saito, K.; Yamakawa, H.; Choi, S.S.; Yamaguchi, K.; Yonezawa, T.; Teruya, T.; Nagai, K.; Woo, J.T. Nobiletin improves hyperglycemia and insulin resistance in obese diabetic ob/ob mice. Biochem. Pharmacol. 2010, 79, 1674–1683.
39. Sim, M.K.; Xu, X.G.; Wong, Y.C.; Sim, S.Z.; Lee, K.O. Des-aspartate-angiotensin I exerts hypoglycemic action via glucose transporter-4 translocation in type 2 diabetic kkay mice and gk rats. Endocrinology 2007, 148, 5925–5932.
40. Taniguchi, C.M.; Emanuelli, B.; Kahn, C.R. Critical nodes in signalling pathways: Insights into insulin action. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2006, 7, 85–96.
41. Thirone, A.C.; Huang, C.; Klip, A. Tissue-specific roles of IRS proteins in insulin signaling and glucose transport. Trends Endocrinol. Metab. 2006, 17, 72–78.
42. Sargis, R.M.; Neel, B.A.; Brock, C.O.; Lin, Y.; Hickey, A.T.; Carlton, D.A.; Brady, M.J. The novel endocrine disruptor tolylfluanid impairs insulin signaling in primary rodent and human adipocytes through a reduction in insulin receptor substrate-1 levels. Biochim. Biophys. Acta Mol. Basis Dis. 2012, 1822, 952–960.
43. Shao, L.; Liu, K.; Huang, F.; Guo, X.; Wang, M.; Liu, B. Opposite effects of quercetin, luteolin, and epigallocatechin gallate on insulin sensitivity under normal and inflammatory conditions in mice. Inflammation 2013, 36, 1–14.
44. Choi, K.; Kim, Y.B. Molecular mechanism of insulin resistance in obesity and type 2 diabetes. Korean J. Intern. Med. 2010, 25, 119–129.
45. Zhang, W.Y.; Lee, J.J.; Kim, Y.; Kim, I.S.; Han, J.H.; Lee, S.G.; Ahn, M.J.; Jung, S.H.; Myung, C.S. Effect of eriodictyol on glucose uptake and insulin resistance in vitro. J. Agric. Food Chem. 2012, 60, 7652–7658.
46. Kolnes, A.J.; Ingvaldsen, A.; Bolling, A.; Stuenaes, J.T.; Kreft, M.; Zorec, R.; Shepherd, P.R.; Jensen, J. Caffeine and theophylline block insulin-stimulated glucose uptake and PKB phosphorylation in rat skeletal muscles. Acta Physiol. 2010, 200, 65–74.
47. McClenaghan, N.H. Physiological regulation of the pancreatic β-cell: Functional insights for understanding and therapy of diabetes. Exp. Physiol. 2007, 92, 481–496.
48. Giani, J.F.; Mayer, M.A.; Munoz, M.C.; Silberman, E.A.; Hocht, C.; Taira, C.A.; Gironacci, M.M.; Turyn, D.; Dominici, F.P. Chronic infusion of angiotensin-(1–7) improves insulin resistance and hypertension induced by a high-fructose diet in rats. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 2009, 296, E262–E271.
49. Wang, Z.Q.; Zhang, X.H.; Yu, Y.; Poulev, A.; Ribnicky, D.; Floyd, Z.E.; Cefalu, W.T. Bioactives from bitter melon enhance insulin signaling and modulate acyl carnitine content in skeletal muscle in high-fat diet-fed mice. J. Nutr. Biochem. 2011, 22, 1064–1073.
50. Kim, J.W.; Kim, S.U.; Lee, H.S.; Kim, I.; Ahn, M.Y.; Ryu, K.S. Determination of 1-deoxynojirimycin in Morus alba L. leaves by derivatization with 9-fluorenylmethyl chloroformate followed by reversed-phase high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A 2003, 1002, 93–99.
51. Hagberg, C.E.; Mehlem, A.; Falkevall, A.; Muhl, L.; Fam, B.C.; Ortsater, H.; Scotney, P.; Nyqvist, D.; Samén, E.; Lu, L.; et al. Targeting VEGF-B as a novel treatment for insulin resistance and type 2 diabetes. Nature 2012, 490, 426–430.
52. Hsu, F.L.; Huang, C.F.; Chen, Y.W.; Yen, Y.P.; Wu, C.T.; Uang, B.J.; Yang, R.S.; Liu, S.H. Antidiabetic effects of pterosin A, a small-molecular-weight natural product, on diabetic mouse models. Diabetes 2013, 62, 628–638.
53. Lee, H.J.; Ok, H.M.; Kwon, O. Protective effects of Korean red ginseng against alcohol-induced fatty liver in rats. Molecules 2015, 20, 11604–11616.
54. Ha, B.G.; Nagaoka, M.; Yonezawa, T.; Tanabe, R.; Woo, J.T.; Kato, H.; Chung, U.I.; Yagasaki, K. Regulatory mechanism for the stimulatory action of genistein on glucose uptake in vitro and in vivo. J. Nutr. Biochem. 2012, 23, 501–509.
2. Goh, S.Y.; Cooper, M.E. Clinical review: The role of advanced glycation end products in progression and complications of diabetes. J. Clin. Endocrinol. Metab. 2008, 93, 1143–1152.
3. Al-Malki, A.L.; Barbour, E.K.; Abulnaja, K.O.; Moselhy, S.S. Management of hyperglycaemia by ethyl acetate extract of Balanites aegyptiaca (desert date). Molecules 2015, 20, 14425–14434.
4. Beit-Yannai, E.; Ben-Shabat, S.; Goldschmidt, N.; Chapagain, B.P.; Liu, R.H.; Wiesman, Z. Antiproliferative activity of steroidal saponins from Balanites aegyptiaca—An in vitro study. Phytochem. Lett. 2011, 4, 43–47.
5. Whiting, D.R.; Guariquata, L.; Weil, C.; Shaw, J. IDF diabetes atlas: Global estimates of the prevalence of diabetes for 2011 and 2030. Diabetes Res. Clin. Pract. 2011, 94, 311–321.
6. Guariguata, L.; Nolan, T.; Beagley, J.; Linnenkamp, U.; Jacqmain, O. IDF Diabetes Atlas, 6th ed.; International Diabetes Federation: Brussels, Belgium, 2013; p. 160.
7. Bakar, M.H.A.; Sarmidi, M.R.; Cheng, K.K.; Khan, A.A.; Chua, L.S.; Huri, H.Z.; Yaakob, H. Metabolomics—The complementary field in systems biology: A review on obesity and type 2 diabetes. Mol. Biosyst. 2015, 11, 1742–1774.
8. Yamashita, Y.; Wang, L.; Tinshun, Z.; Nakamura, T.; Ashida, H. Fermented tea improves glucose intolerance in mice by enhancing translocation of glucose transporter 4 in skeletal muscle. J. Agric. Food Chem. 2012, 60, 11366–11371.
9. Kooij, R.; Branderhorst, H.M.; Bonte, S.; Wieclawska, S.; Martin, N.I.; Pieters, R.J. Glycosidase inhibition by novel guanidinium and urea iminosugar derivatives. Med. Chem. Comm. 2013, 4, 387–393.
10. Tsuduki, T.; Kikuchi, I.; Kimura, T.; Nakagawa, K.; Miyazawa, T. Intake of mulberry 1-deoxynojirimycin prevents diet-induced obesity through increases in adiponectin in mice. Food Chem. 2013, 139, 16–23.
11. Asano, N.; Yamashita, T.; Yasuda, K.; Ikeda, K.; Kizu, H.; Kameda, Y.; Kato, A.; Nash, R.J.; Lee, H.S.; Ryu, K.S. Polyhydroxylated alkaloids isolated from mulberry trees (Morus alba L.) and silkworms (Bombyx mori L.). J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 4208–4213.
12. Kimura, M.; Chen, F. Antihyperglycemic effects of N-containing sugars derived from mulberry leaves is streptozocin-in-duced diabetic mice. Wakan Iyakugaku Zasshi 1995, 12, 214–219.
13. Yagi, M.; Kouno, T.; Aoyagi, Y.; Murai, H. The structure of moranoline, a peperidine alkaloid from Morus species. Nippon Nogei Kagaku Kaishi 1976, 50, 571–572.
14. Zechel, D.L.; Boraston, A.B.; Gloster, T.; Boraston, C.M.; Macdonald, J.M.; Tilbrook, D.M.; Stick, R.V.; Davies, G.J. Iminosugar glycosidase inhibitors: Structural and thermodynamic dissection of the binding of isofagomine and 1-deoxynojirimycin to β-glucosidases. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 14313–14323.
15. Cheatham, B.; Vlahos, C.J.; Cheatham, L.; Wang, L.; Blenis, J.; Kahn, C.R. Phosphatidylinositol 3-kinase activation is required for insulin stimulation of pp70 S6 kinase, DNA synthesis, and glucose transporter translocation. Mol. Cell Biol. 1994, 14, 4902–4911.
16. Le Marchand-Brustel, Y.; Gautier, N.; Cormont, M.; van Obberghen, E. Wortmannin inhibits the action of insulin but not that of okadaic acid in skeletal muscle: Comparison with fat cells. Endocrinology 1995, 136, 3564–3570.]
17. Nakagawa, K.; Kubota, H.; Kimura, T.; Yamashita, S.; Tsuzuki, T.; Oikawa, S.; Miyazawa, T. Occurrence of orally administered mulberry 1-deoxynojirimycin in rat plasma. J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 8928–8933.
18. Blonde, L. Current antihyperglycemic treatment guidelines and algorithms for patients with type 2 diabetes mellitus. Am. J. Med. 2010, 123, 12–18.
19. DeFronzo, R.A. Pathogenesis of type 2 diabetes: Metabolic and molecular implications for identifying diabetes genes. Diabetes Rev. 1997, 5, 177–269.
20. Lanza, I.R.; Sreekumaran Nair, K. Regulation of skeletal muscle mitochondrial function: Genes to proteins. Acta Physiol. 2010, 199, 529–547.
21. Shulman, G.I.; Rothman, D.L.; Jue, T.; Stein, P.; Defronzo, R.A.; Shulman, R.G. Quantitation of muscle glycogen-synthesis in normal subjects and subjects with non-insulin-dependent diabetes by c-13 nuclear magnetic-resonance spectroscopy. N. Engl. J. Med. 1990, 322, 223–228.
22. Defronzo, R.A.; Jacot, E.; Jequier, E.; Maeder, E.; Wahren, J.; Felber, J.P. The effect of insulin on the disposal of intravenous glucose. Results from indirect calorimetry and hepatic and femoral venous catheterization. Diabetes 1981, 30, 1000–1007.
23. Defronzo, R.A. Pathogenesis of type 2 diabetes mellitus. Med. Clin. N. Am. 2004, 88, 787–835.
24. Defronzo, R.A. Banting Lecture. From the triumvirate to the ominous octet: A new paradigm for the treatment of type 2 diabetes mellitus. Diabetes 2009, 58, 773–795.
25. Akira, A.; Nakaqawa, K.; Hiquchi, O.; Kimura, T.; Kojima, Y.; Kariya, J.; Miyazawa, T.; Oikawa, S. Effect of mulberry leaf extract with enriched 1-deoxynojirimycin content on postprandial glycemic control in subjects with impaired glucose metabolism. J. Diabetes Investig. 2011, 2, 318–323.
26. Wang, T.; Li, C.Q.; Zhang, H.; Li, J.W. Response surface optimized extraction of 1-deoxynojirimycin from mulberry leaves (Morus alba L.) and preparative separation with resins. Molecules 2014, 19, 7040–7056.
27. Kong, W.H.; Oh, S.H.; Ahn, Y.R.; Kim, K.W.; Kim, J.H.; Seo, S.W. Antiobesity effects and improvement of insulin sensitivity by 1-deoxynojirimycin in animal models. J. Agric. Food Chem. 2008, 56, 2613–2619.
28. Nam, Y.; Jung, H.; Karuppasamy, S.; Lee, J.Y.; Kang, K.D.; Hwang, K.Y.; Seong, S.I.; Suh, J.G. Anti-hyperlipidemic effect of soybean extract fermented by Bacillus subtilis MORI in db/db mice. Lab. Anim. Res. 2012, 28, 123–129.
29. Kobayashi, K.; Forte, T.M.; Taniguchi, S.; Ishida, B.Y.; Oka, K.; Chan, L. The db/db mouse, a model for diabetic dyslipidemia: Molecular characterization and effects of Western diet feeding. Metabolism 2000, 49, 22–31.
30. Burra, P. Liver abnormalities and endocrine diseases. Best Pract. Res. Clin. Gastroenterol. 2013, 27, 553–563.
31. Eckel, R.H.; Grundy, S.M.; Zimmet, P.Z. The metabolic syndrome. Lancet 2005, 365, 1415–1428.
32. Kwon, H.J.; Chung, J.Y.; Kim, J.Y.; Kwon, O. Comparison of 1-deoxynojirimycinand aqueous mulberry leaf extract with emphasis on postprandial hypoglycemic effects: In vivo and in vitro studies. J. Agric. Food Chem. 2011, 59, 3014–3019.
33. Li, Y.G.; Ji, D.F.; Zhong, S.; Lv, Z.Q.; Lin, T.B. Cooperative anti-diabetic effects of deoxynojirimycin-polysaccharide by inhibiting glucose absorption and modulating glucose metabolism in streptozotocin-induced diabetic mice. PLoS ONE 2013, 8, e65892.
34. Li, Y.G.; Ji, D.F.; Zhong, S.; Lv, Z.Q.; Lin, T.B.; Chen, S.; Hu, G.Y. Hybrid of 1-deoxynojirimycin and polysaccharide from mulberry leaves treat diabetes mellitus by activating PDX-1/insulin-1 signaling pathway and regulating the expression of glucokinase, phosphoenolpyruvate carboxykinase and glucose-6-phosphatase in alloxan-induced diabetic mice. J. Ethnopharmacol. 2011, 134, 961–970.
35. Li, Y.G.; Ji, D.F.; Zhong, S.; Lin, T.B.; Lv, Z.Q.; Hu, G.Y.; Wang, X. 1-deoxynojirimycin inhibits glucose absorption and accelerates glucose metabolism in streptozotocin-induced diabetic mice. Sci. Rep. 2013, 3, 1377.
36. Benalla, W.; Bellahcen, S.; Bnouham, M. Antidiabetic medicinal plants as a source of α-glucosidase inhibitors. Curr. Diabetes Rev. 2010, 6, 247–254.
37. Kim, S.; Jwa, H.; Yanagawa, Y.; Park, T. Extract from Dioscorea batatas ameliorates insulin resistance in mice fed a high-fat diet. J. Med. Food 2012, 15, 527–534.
38. Lee, Y.S.; Cha, B.Y.; Saito, K.; Yamakawa, H.; Choi, S.S.; Yamaguchi, K.; Yonezawa, T.; Teruya, T.; Nagai, K.; Woo, J.T. Nobiletin improves hyperglycemia and insulin resistance in obese diabetic ob/ob mice. Biochem. Pharmacol. 2010, 79, 1674–1683.
39. Sim, M.K.; Xu, X.G.; Wong, Y.C.; Sim, S.Z.; Lee, K.O. Des-aspartate-angiotensin I exerts hypoglycemic action via glucose transporter-4 translocation in type 2 diabetic kkay mice and gk rats. Endocrinology 2007, 148, 5925–5932.
40. Taniguchi, C.M.; Emanuelli, B.; Kahn, C.R. Critical nodes in signalling pathways: Insights into insulin action. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2006, 7, 85–96.
41. Thirone, A.C.; Huang, C.; Klip, A. Tissue-specific roles of IRS proteins in insulin signaling and glucose transport. Trends Endocrinol. Metab. 2006, 17, 72–78.
42. Sargis, R.M.; Neel, B.A.; Brock, C.O.; Lin, Y.; Hickey, A.T.; Carlton, D.A.; Brady, M.J. The novel endocrine disruptor tolylfluanid impairs insulin signaling in primary rodent and human adipocytes through a reduction in insulin receptor substrate-1 levels. Biochim. Biophys. Acta Mol. Basis Dis. 2012, 1822, 952–960.
43. Shao, L.; Liu, K.; Huang, F.; Guo, X.; Wang, M.; Liu, B. Opposite effects of quercetin, luteolin, and epigallocatechin gallate on insulin sensitivity under normal and inflammatory conditions in mice. Inflammation 2013, 36, 1–14.
44. Choi, K.; Kim, Y.B. Molecular mechanism of insulin resistance in obesity and type 2 diabetes. Korean J. Intern. Med. 2010, 25, 119–129.
45. Zhang, W.Y.; Lee, J.J.; Kim, Y.; Kim, I.S.; Han, J.H.; Lee, S.G.; Ahn, M.J.; Jung, S.H.; Myung, C.S. Effect of eriodictyol on glucose uptake and insulin resistance in vitro. J. Agric. Food Chem. 2012, 60, 7652–7658.
46. Kolnes, A.J.; Ingvaldsen, A.; Bolling, A.; Stuenaes, J.T.; Kreft, M.; Zorec, R.; Shepherd, P.R.; Jensen, J. Caffeine and theophylline block insulin-stimulated glucose uptake and PKB phosphorylation in rat skeletal muscles. Acta Physiol. 2010, 200, 65–74.
47. McClenaghan, N.H. Physiological regulation of the pancreatic β-cell: Functional insights for understanding and therapy of diabetes. Exp. Physiol. 2007, 92, 481–496.
48. Giani, J.F.; Mayer, M.A.; Munoz, M.C.; Silberman, E.A.; Hocht, C.; Taira, C.A.; Gironacci, M.M.; Turyn, D.; Dominici, F.P. Chronic infusion of angiotensin-(1–7) improves insulin resistance and hypertension induced by a high-fructose diet in rats. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 2009, 296, E262–E271.
49. Wang, Z.Q.; Zhang, X.H.; Yu, Y.; Poulev, A.; Ribnicky, D.; Floyd, Z.E.; Cefalu, W.T. Bioactives from bitter melon enhance insulin signaling and modulate acyl carnitine content in skeletal muscle in high-fat diet-fed mice. J. Nutr. Biochem. 2011, 22, 1064–1073.
50. Kim, J.W.; Kim, S.U.; Lee, H.S.; Kim, I.; Ahn, M.Y.; Ryu, K.S. Determination of 1-deoxynojirimycin in Morus alba L. leaves by derivatization with 9-fluorenylmethyl chloroformate followed by reversed-phase high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A 2003, 1002, 93–99.
51. Hagberg, C.E.; Mehlem, A.; Falkevall, A.; Muhl, L.; Fam, B.C.; Ortsater, H.; Scotney, P.; Nyqvist, D.; Samén, E.; Lu, L.; et al. Targeting VEGF-B as a novel treatment for insulin resistance and type 2 diabetes. Nature 2012, 490, 426–430.
52. Hsu, F.L.; Huang, C.F.; Chen, Y.W.; Yen, Y.P.; Wu, C.T.; Uang, B.J.; Yang, R.S.; Liu, S.H. Antidiabetic effects of pterosin A, a small-molecular-weight natural product, on diabetic mouse models. Diabetes 2013, 62, 628–638.
53. Lee, H.J.; Ok, H.M.; Kwon, O. Protective effects of Korean red ginseng against alcohol-induced fatty liver in rats. Molecules 2015, 20, 11604–11616.
54. Ha, B.G.; Nagaoka, M.; Yonezawa, T.; Tanabe, R.; Woo, J.T.; Kato, H.; Chung, U.I.; Yagasaki, K. Regulatory mechanism for the stimulatory action of genistein on glucose uptake in vitro and in vivo. J. Nutr. Biochem. 2012, 23, 501–509.