Полисахарид листьев шелковицы белой (Morus alba) улучшает состояние микробиоты кишечника при инсулинорезистентности и избыточном отложении жиров, а также метаболизм липидов у мышей с искусственно вызв
Mulberry (Morus alba L.) leaf polysaccharide ameliorates insulin resistance-and adipose deposition-associated gut microbiota and lipid metabolites in high-fat diet-induced obese mice Xin Zhao, Zhifei Fu, Minghe Yao, Yu Cao, Tongtong Zhu, Rui Mao, Ming Huang, Yafen Pang, Xianghui Meng, Lin Li, Boli Zhang, Yuhong Li, Han Zhang
Перевод: Е. Крохмалева Редактура: Н. Готманова (основная), Д. Храброва Ключевые слова: микробиота кишечника, инсулинорезистентность, липиды, метаболическое нарушение, полисахарид листьев шелковицы, ожирение Список сокращений: ПЛШ – полисахарид листьев шелковицы белой, ВЖД – высокожировая диета, ИР – инсулинорезистентность, ГКН – уровень глюкозы в крови натощак, ИН – уровень инсулина натощак, ТТГ – тест на толерантность к глюкозе, ППК – площадь под кривой, ОХ – общий холестерин плазмы, вПЛШ – высокая доза ПЛШ, нПЛШ – низкая доза ПЛШ, Ф/Б – соотношение фирмикуты/бактероиды.
Краткое содержание Современные биологически активные добавки способны улучшать метаболизм путем поддержания баланса микрофлоры кишечника. Лекарственные свойства при употреблении в пищу проявляют и листья шелковицы, положительно влияя на уровни глюкозы и липидов. Однако воздействие полисахарида листьев шелковицы (ПЛШ) на метаболический дисбактериоз и кишечную микробиоту на сегодняшний день изучено не в полной мере. В настоящей работе после экстракции из листьев растения и определения состава благотворные эффекты водорастворимого препарата ПЛШ оценивали на экспериментальных мышах с ожирением, вызванным высокожировой диетой (ВЖД). Установлено, что ПЛШ способен снижать содержание жировой ткани, инсулинорезистентность и степень патологических поражений толстой кишки. Исследования на молекулярном уровне (составление профиля 16S рРНК и липидного профиля плазмы) показали, что ПЛШ улучшает состояние микробного ансамбля кишечника и восстанавливает нормальные показатели липидного обмена. Применение корреляционных подходов выявило, что преобладание семи ключевых видов бактерий и шести типов липидов непосредственно связано с метаболическими изменениями. В целом, к свойствам ПЛШ можно отнести коррекцию метаболических нарушений, модификацию кишечной микробиоты и липидного состава. Эти данные в значительной степени повышают интерес к использованию ПЛШ в качестве функционального продукта питания.
1. ВВЕДЕНИЕ Листья шелковицы белой (Morus alba), относящейся к семейству Moraceae, являются одним из наиболее часто используемых источников традиционных китайских лекарств. Например, листья растения служат функциональными продуктами питания при лечении диабета и его осложнений (Lown et al., 2017; Riche et al., 2017). Фитохимические и фармакологические исследования показали, что терапевтический эффект листьев шелковицы белой обусловлен наличием ряда биологически активных соединений, таких как полисахариды, флавоноиды, полифенолы и алкалоиды (Ge et al., 2018; Li et al., 2019; Meng et al., 2020; Wang et al., 2021;Zhao et al., 2019). В последнее время чай из листьев шелковицы белой привлекает большое внимание как пищевая добавка с лечебным эффектом (He et al., 2018). Доказано, что водорастворимый полисахарид из листьев шелковицы белой (ПЛШ), одно из основных биоактивных соединений растения, обладает превосходными гипогликемическими, противовоспалительными, антиоксидантными и иммуномодулирующими свойствами, а также улучшает состояние кишечной микробиоты и препятствует фиброзу тканей почек (Chen et al., 2021; Khan et al., 2019; Wang et al., 2020; Wu, 2019; Zhang et al ., 2019). В частности, ПЛШ улучшает метаболизм глюкозы и снижает инсулинорезистентность (ИР) у крыс с диабетом 2 типа (Ren et al., 2015). Однако фармакологические механизмы этих эффектов еще предстоит выяснить.
Диетические вмешательства, затрагивающие микробиоту кишечника, также могут быть направлены на профилактику и лечение метаболических расстройств, таких как ИР, ожирение и диабет (Chambers et al., 2019). Пилотное исследование Дель Керико и др. (2021) показало снижение разнообразия кишечной микробиоты у пациентов с ИР. У индивидов с метаболическими осложнениями наблюдается снижение численности бактерий Bifidobacterium и Akkermansia, а также увеличение соотношения фирмикуты/бактероиды (Ф/Б) (Vallianou et al., 2019). Сообщалось, что многие полисахариды улучшают показатели, связанные с метаболическими нарушениями на животных моделях, через влияние на состав микробиома кишечника за счет снижения соотношения Ф/Б (Chen et al., 2020; Gu et al., 2020; Shi et al., 2015). Взаимодействие бактерий и лекарственных средств in vitro показало, что как Bacteroides cellulosilyticus, так и Bacteroides ovatus способны генерировать ацетат и пропионат с использованием ПЛШ (Wang et al., 2020). Чжао и др . (2019) сообщили, что ПЛШ снижает уровень Escherichia coli и увеличивает количество лактобацилл и бифидобактерий в кишечнике у поросят раннего отъема. Регулирование ПЛШ общего бактериального состава на уровнях типа (т. е. Ф/ Б) и рода остается открытым вопросом. Поэтому наша цель заключалась в изучении механизмов потенциального участия ПЛШ в коррекции ИР и метаболических нарушений с позиции влияния на кишечную микробиоту.
Чрезмерное потребление жиров с пищей повышает риск развития ИР, ожирения и диабета 2 типа, которые часто сопровождаются нарушениями липидного обмена. Преобладание лизофосфолипидов , плазмалогенов фосфатидилхолина , сфингомиелинов и сложных эфиров холестерина в липидном профиле ассоциируется с более низким риском развития диабета, а триацилглицеридов , диацилглицеридов и фосфатидилэтаноламинов , напротив, с более высоким (Razquin et al., 2018). При составлении липидных профилей масс-спектрометрические подходы обеспечивают быструю и комплексную характеристику метаболизма липидов и пригодны не только для рутинного тестирования общего холестерина (ОХ) и триглицеридов (TG), но и для определения биомаркеров, связанных с метаболическими заболеваниями (Hu & Zhang , 2018 ). В связи с этим, обнаружение средствами липидомики маркерных липидов, ассоциированных с потреблением ПЛШ, представляется наиболее целесообразным. Кроме того, последующая идентификация и выделение молекул данных липидов также могут представлять интерес с позиций фармакологии. В свою очередь, кишечная микробиота также способна повлиять на метаболизм липидов (Matey-Hernandez et al., 2018).
В нашем исследовании благотворные эффекты и потенциальные терапевтические механизмы действия ПЛШ были оценены на мышах, подвергнутых ВЖД. Были определены метаболически е параметры, состав кишечной микробиоты и липидные профили плазмы экспериментальных животных. Кроме того, мы выявили взаимосвязь между составом кишечной микробиоты, липидомом и метаболическими изменениями, вызванными ПЛШ. Опираясь на полученные результаты, мы предполагаем, что ПЛШ может найти применение в качестве незаменимой пищевой добавки для лечения ИР, улучшения состояния микробиоты кишечника и липидного обмена.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ 3.1. Первичная характеристика ПЛШ Результаты анализа фенол-сернокислотным методом показали, что ПЛШ содержит 35,72% ± 0,035% углеводов. Количество уроновой кислоты в ПЛШ, определенное карбазолсульфатным методом, составляло 2,62% ± 1,19%. Содержание белка в ПЛШ составляло 12,81% ± 0,66%. Эти результаты показывают, что ПЛШ является кислым полисахаридом. Молекулярно-массовое распределение ПЛШ получали с использованием высокоэффективной гельпроникающей хроматографии. Результат представлен на рис. S1, a. Хроматограмма молекулярно-массового распределения ПЛШ содержит два основных пика. Первый пик, охватывающий диапазон от 10,9 мин до 12,5 мин, имеет молекулярную массу 203-838 кДа; второй пик, охватывающий широкий диапазон от 12,5 до 19,8 мин, представлен молекулярными массами 0,3-203 кДа. В состав ПЛШ входило восемь моносахаридов, включая маннозу, рамнозу, глюкуроновую кислоту, галактуроновую кислоту, глюкозу, галактозу, арабинозу и фукозу, в молярном соотношении 1,00:1,16:0,80:2,11:5,12:2,37:2,16:0,73, соответственно (рис. S1, b).
3.2. Положительное влияние ПЛШ на параметры метаболизма у мышей на высокожировой диете 3.2.1. Снижение общей массы тела, массы печени и жировой ткани Сравнение массы тела и потребления калорий за 24 часа в трех группах представлено на рис. 1 (a, b). Мыши из группы ВЖД имели одинаковую массу тела с мышами контрольной группы в начале эксперимента и значительно набирали массу тела с 8-й недели (p < 0,05, по сравнению с Con). В группе вПЛШ наблюдалось значительное снижение массы тела по сравнению с группой ВЖД на 12-й неделе с 34,26 ± 1,25 г до 30,15 ± 1,50 г (p < 0,05, по сравнению с ВЖД; рис. 1, a). Данная тенденция к снижению веса продолжалась до 20-й недели с 44,37 ± 1,07 г до 34,26 ± 2,29 г (р < 0,01, по сравнению с ВЖД). В группе нПЛШ масса тела мышей также незначительно снижалась (р < 0,01 по сравнению с ВЖД). По сравнению с контрольной группой, мыши, подвергнутые ВЖД, потребляли значительно больше калорий. Добавление ПЛШ существенно не повлияло на потребление калорий (рис. 1, b), но заметно ослабляло вызванный ВЖД стеатоз печени, что проявлялось в уменьшении кавитации тканей и агрегации липидных капель. При введении вПЛШ также уменьшался объем эпидидимальных адипоцитов (рис. 1, c). В условиях ВЖД значительно увеличивались масса бурого жира, подкожного жира, эпидидимального жира и печени. В свою очередь, введение вПЛШ уменьшало массу подкожного жира, эпидидимального жира и печени (p < 0,01, по сравнению с ВЖД), а также незначительно увеличивало массу бурого жира, который отвечает за энергозатраты на согревание тела и помогает сбросить вес (рис. 1, d). Введение низкой дозы ПЛШ (нПЛШ) также уменьшало количество подкожного жира и массу печени (p < 0,01, p < 0,05 по сравнению с ВЖД). Соотношение массы жировой ткани к массе тела соответствовало той же тенденции (рис. 1, е).
Рис. 1. https://drive.google.com/file/d/1yrbbdYquToa926SdlK2JQjQWirymHA_2/view?usp=share_link Снижение массы тела и жировой ткани при добавках ПЛШ в рацион мышей на ВЖД. (a) Изменения массы тела у мышей на стандартной диете/ВЖД при отсутствии/наличии ежедневного введения ПЛШ на протяжении 20 недель. (b) Количество калорий, потребляемых различными группами мышей. (c) Гистологический анализ ткани печени и эпидидимальной жировой ткани (окрашивание H&E и масляным красным O, черта – масштаб 200 мкм). (d) Показатели массы тканей и (e) соотношения массы органа/ ткани к массе тела у мышей в трех группах (n = 8–10, *p < 0 ,05, **p < 0 ,01, по сравнению с Con; *p < 0 ,05, **p < 0,01, по сравнению с ВЖД).
3.2.2. ПЛШ повышает толерантность к глюкозе, снижает резистентность к инсулину и уровень некоторых липидов в плазме Чтобы оценить, как организм управляет уровнем глюкозы в крови после приема пищи при добавках ПЛШ, был проведен тест на толерантность к глюкозе (ТТГ) (рис. 2, a, b). По сравнению с группой Con, у мышей группы ВЖД наблюдалось значительное повышение уровня глюкозы в крови в течение 2 ч после ТТГ и достижение максимальной концентрации глюкозы через 30 мин. Снижение последнего показателя через 30 мин после начала теста наблюдалось в группе, получавшей вПЛШ, с 30,11 ± 1,35 ммоль · л‐ 1 до 23,32 ± 0,68 ммоль· л‐ 1 (p <0,01 по сравнению с ВЖД ). Кроме того, ППК ТТГ была выше у мышей группы ВЖД, чем у группы Con (p <0,01) на 20‐й неделе. Введение вПЛШ уменьшило ППК ТТГ с 44,67 ± 2,98 до 33,02 ± 1,44 (× 102) (p <0 ,01, по сравнению с ВЖД). Поскольку в условиях ВЖД наблюдалось повышение уровней ГКН и ИН (p <0,01 по сравнению с Con), то для оценки эффектов ПЛШ также принимались в расчет параметры инсулинорезистентности. Результаты показали, что вПЛШ заметно снижает уровни ГКН и ИН (p <0,05 по сравнению с ВЖД; рис. 2, c, d). Индекс инсулинорезистентности HOMA был повышен в группе ВЖД, что указывает на более низкую чувствительность к инсулину по сравнению с группой Con (p <0,01 по сравнению с группой Con ). В то же время, в группе мышей, получавших вПЛШ, данный индекс снижался до уровней, наблюдавшихся у животных, которые получали стандартную диету: с 34,24 ± 6,90 до 14,88 ± 2,76 (p <0,01 по сравнению с ВЖД; рис. 2, e). Это позволяет предположить, что вПЛШ способна нивелировать инсулинорезистентность, повышая чувствительность к инсулину у мышей в условиях ВЖД.
Рис. 2. https://drive.google.com/file/d/1h7WYhtIgG26JdLUx_5iz8DsxZYdiP0ax/view?usp=share_link Защитный эффект ПЛШ на метаболизм мышей, содержавшихся на ВЖД. (a) Влияние ПЛШ на толерантность к глюкозе, с помощью ТТГ и (b) площади под кривой (ППК) ТТГ (ППК ТТГ). (c) Уровни глюкозы в крови натощак ( ГКН), (d) уровни инсулина натощак ( ИН), (e) индексы HOMA-IR , (f) лептин плазмы, (g) общий холестерин ( ОХ), (h) триглицериды плазмы (TG ), (i) уровни свободных жирных кислот ( FFA) и (j) липополисахаридов ( LPS) у мышей с ожирением, вызванным ВЖД (n = 8-10, *p < 0,05, **p < 0,01, по сравнению с Con ; *p < 0,05, **p < 0,01, по сравнению с ВЖД).
Вместе с тем, другие ВЖД-ассоциированные метаболические параметры, в частности, уровни лептина и ОХ в плазме, были заметно повышены у мышей, получавших ВЖД (p <0,01, по сравнению с Con ). Впервые было показано, что вПЛШ заметно снижает уровень лептина с 6,43 ± 1,49 нг· мл‐1 до 4,36 ± 1,28 нг· мл‐ 1 (p <0,05 по сравнению с ВЖД; рис. 2, f). Как неоднократно сообщалось ранее , добавки вПЛШ значительно снижают уровень ОХ у мышей на ВЖД с 4,40 ± 0,36 ммоль· л‐ 1 до 3,15 ± 0,39 ммоль· л‐1 ( p < 0,05 по сравнению с ВЖД; рис. 2, g; Zhang et al ., 2014 , 2018 ). Введение низких доз ПЛШ статистически не влияло на значения ТТГ, ГКН, ИН, HOMA-IR, уровни лептина и ОХ. В данном исследовании у мышей, подвергнутых ВЖД, не наблюдалось значительного увеличения TG, FFA и LPS (p> 0,05 по сравнению с Con; рис. 2, h-j). Примечательно, что у мышей, получавших вПЛШ, в значительной степени снижались уровни FFA и LPS (p <0,01 по сравнению с ВЖД). Та же тенденция была обнаружена и у мышей, получавших нПЛШ.
3.3. ПЛШ оказывает положительный эффект на патологические изменения ткани толстой кишки у мышей, содержавшихся на ВЖД Гистопатологические изменения в каждой группе мышей представлены на рис. 3, а. По сравнению с группой Con в группе ВЖД наблюдались отек и гиперплазия соединительной ткани в подслизистой толстого кишечника. При этом интерстициальное пространство было значительно увеличено, что сопровождалось небольшим количеством очаговой инфильтрации воспалительных клеток. После введения высокой дозы ПЛШ (вПЛШ) была относительно восстановлена целостность толстой кишки при меньшей инфильтрации воспалительными клетками. Результаты иммунофлуоресцентной микроскопии показали, что белок ZO-1 в основном экспрессируется в эпителиальном слое слизистой оболочки кишечника. Последующая обработка вПЛШ привела к значительному повышению интенсивности флуоресценции белка ZO-1. В то же время, в группе мышей, получавших нПЛШ, не наблюдалось очевидных патологических изменений (по сравнению с группой ВЖД) во всех исследованных тканях толстой кишки. Изображения, полученные с помощью флуоресцентной микроскопии, представлены на рисунке 3, b.
3.4. ПЛШ повышает разнообразие кишечной микробиоты и снижает соотношение Ф/Б у мышей на ВЖД Подходы к оценке альфа‐разнообразия, включая chao1, ACE, наблюдаемые виды и определение индекса Шеннона, использовались для описания сложности и видового разнообразия микробиоты кишечника мышей в разных образцах (рис. 4, a-d). ВЖД привела к снижению разнообразия кишечной микробиоты: по сравнению с группой Con, chao1, ACE и наблюдаемый видовой индекс оказались значительно ниже в группе ВЖД (p <0,01 по сравнению с Con). Однако различий в индексе Шеннона между группами Con и HFD не наблюдалось. При приеме высоких доз ПЛШ индекс chao1 значительно увеличивался с 368,8 ± 11,29 до 491,6 ± 12,05 (p <0 ,01, по сравнению с ВЖД). Аналогичная тенденция к повышению после введения ПЛШ также была обнаружена в параметре ACE (с 369,8 ± 10,86 до 491,3 ± 12,38), наблюдаемых видах (с 351,6 ± 10,02 до 471,1 ± 9,92) и индексе Шеннона (с 4,8 ± 0,14 до 5,7 ± 0,11). Взвешенный анализ базовых координат на основе UniFrac (PCoA) показал очевидную разницу между группами ВЖД и Con после 20-недельной диеты с высоким содержанием жиров, а также образцами после приема ПЛШ, расположенными между образцами ВЖД и Con (рис. 4, e). На уровне типа бактерии Bacteroidetes, Firmicutes, Proteobacteria, Deferribacteres и неопознанные бактерии являются наиболее распространенными в микробиоте кишечника мышей (рис. 4, f). По сравнению с группой Con, у мышей, получавших ВЖД, оказалось больше Firmicutes (p <0,01), но меньше Bacteroidetes ( p < 0,01 ). После введения ПЛШ состав микробиоты кишечника изменился в сторону группы Con, что видно по значительному снижению соотношения Ф/Б (p <0,01 по сравнению с ВЖД; рис. 4, g-i).
Рис. 4. https://drive.google.com/file/d/18749Ia632oFThivpDzrOXl0UXuOdojSu/view?usp=share_link Параметры оценки альфа‐разнообразия микробиоты кишечника в различных группах мышей: (a) chao1; (b) ACE; (c) наблюдаемые виды; (d) индекс Шеннона. (e) Оценка бета‐ разнообразия взвешенных PCoA на основе UniFrac различных групп мышей. (f) Относительное разнообразие бактериальных сообществ на уровнях общего типа, (g) Firmicutes, (h) Bacteroidetes и (i) соотношение Ф/ Б (n = 8-10, *p <0,05, **p <0,01 по сравнению с Con ; *p <0,05, **p <0,01, по сравнению с ВЖД).
3.5. Корреляции между ключевыми микробными филотипами и параметрами, связанными с приемом ПЛШ На уровне рода, по сравнению с группой Con, в группе ВЖД оказалось больше бактерий Mucispirillum, Dubosiella, Faecalibacullum, Lactococcus и Desulfovibrio (p <0,05), но меньше Muribaculum (p <0,001). Когда мышам, содержавшимся на ВЖД, вводили ПЛШ, количество Mucispirillum, Dubosiella, Faecalibacullum, Lactococcus и Desulfovibrio уменьшалось (p <0,05), а Muribaculum, Bacteroides, Erysipelatoclostridium, Akkermansia и Anaeroplasma увеличивалось (p <0,05; рис. 5, a). Для того чтобы выявить взаимосвязь распространенности ключевых штаммов бактерий и метаболических параметров, использовали корреляционный анализ Спирмена (рис. 5, b). При значительном снижении количества родов бактерий, характерных для приема ПЛШ, Mucispirillum, Lactococcus, Faecalibaculum и Desulfovibrio оказались положительно связаны с индексом инсулинорезистентности и ожирением. Противоположные корреляции наблюдались для Muribaculum и Anaeroplasma. В частности, численность рода Desulfovibrio положительно коррелировала с большинством параметров метаболических нарушений в данном исследовании.
Рис. 5. https://drive.google.com/file/d/1jso9jlNxN_9Alt7ggZBRv88AAq5mPmDZ/view?usp=share_link (а) Статистический анализ рода бактерий микробиоты кишечника, численность которого значительно различается среди различных групп мышей. Ось y указывает относительную распространенность соответствующего рода. (b) Корреляционный анализ Спирмена между 50 идентифицированными видами бактерий и метаболическими признаками (n = 8-10, *p <0,05, **p <0,01, по сравнению с Con*p <0,05, **p <0,01, по сравнению с ВЖД).
3.6. ПЛШ улучшает липидный профиль мышей, содержавшихся на ВЖД Для составления липидного профиля в плазме мышей различных групп детектировали 20 типов липидов, включая сложный эфир холестерина (CE), дигидрокерамиды (DCER), гексозилцерамиды (HCER), гексозилцерамиды (HexCer), лактозилцерамиды (LacCer), лактозилцерамиды (LCER), глюкозилцерамиды (GluCer), диацилглицерин (DAG), сфингомиелин (SM), триацилглицерин (TAG), лизо фосфатидную кислоту (LPA), фосфатидную кислоту (PA), лизофосфатидилхолин (LPC), фосфатидилхолин (PC), лизофосфатидилэтаноламин (LPE), фосфатидилэтаноламин (PE), фосфатидилглицерины (PG), лизофосфатидилинозитол (LPI), фосфатидилинозитол (PI) и свободные жирные кислоты (FFA) (рис. 6 ). У мышей из группы ВЖД наблюдалось значительное увеличение уровней CE, DECR, HCER, LacCer, LCER, SM и PG по сравнению с контрольной группой (p <0,05), а уровни CE, DCER, LCER, SM и PG были значительно изменены высокой дозой ПЛШ (p <0,05). Кроме того, уровни HCER и LacCer также показали тенденцию к снижению в группе ПЛШ. У мышей на ВЖД наблюдалось значительное снижение содержания HexCer, DAG и TAG по сравнению с контрольной группой (p <0,05), как и содержания FFA, обнаруженных с помощью метода ELISA.
Для выяснения закономерностей кластеризации среди различных групп мышей проводили анализ базовых компонент (PCA). На координаты PC1 и PC2 приходится 41,5% и 23,7% различий, соответственно. Было отмечено, что группа ВЖД четко отличалась от группы Con, в то время как группа ПЛШ отделилась от группы ВЖД (рис. 7, a). Аналогично, модель PLS‐DA показала четкое разделение между группами Con, ВЖД и ПЛШ, предполагая, что нарушения липидного обмена были вызваны ВЖД и восстановлены ПЛШ (рис. 7, b). Значения R 2 (характеристика точности аппроксимации) для модели и Q2 (оценка прогностической способности после перекрестной валидации) для прогноза на положительной модели (R2 = 0 ,718, Q2 = 0, 685) показали, что модель PLS-DA надежна. Большинство образцов в группе мышей, получавшей ПЛШ, были более близки к группе Con. Это означает, что потребление ПЛШ восстановило нарушенный метаболизм до нормального состояния. Модель OPLS‐DA и статистический анализ выявили, в общей сложности, 42 переменные между группами Con и ВЖД (которые были отнесены к потенциальным биомаркерам при значениях фактор а переменной прогнозируемой значимости VIP> 1 и p <0, 05; рис. 7, c, d ). Эти переменные в основном относились к классам CE, FFA, PE, LPE, PG, PI, SM и TAG, включая по одному CE и PI, десять FFA, два LPE, шесть PE, два PG, семь SM и тринадцать TAG. Примечательно, что выраженный эффект наблюдался для FFA 16: 1 (VIP = 9,56 и p = 1,04· 10-4) и SM 16: 0 (VIP = 8,21 и p = 1,94· 10-4 ). После введения ПЛШ у мышей на ВЖД значительно снизились уровни CE (20: 4), СМ (18:0, 18:1, 20:0, 22:0, 22:1), LPE (18:2), PE (18:0/18:2), PG (18:2/16: 1), и FFA (18: 0) ( рис. 7, e, f ).
Рис. 7. https://drive.google.com/file/d/1s9z_f4wP10g0vMBxMuUadoJ0n3P7CCLK/view?usp=share_link (а) Диаграмма кластеризвции по методу PCA (b) Диаграмма кластеризации по методу PLS-DA. (c) Диаграмма кластеризации по методу OPLC-DA между контрольной группой и ВЖД. (d) S-диаграмма OPLS‐DA, сравнивающая характеристики групп Con и ВЖД с липидами, выбранными в качестве биомаркеров, (красный цвет). (e) Диаграмма OPLS-DA, сравнивающая группы ВЖД и ПЛШ. (f) Диаграмма OPLS‐DA, сравнивающая характеристики групп ВЖД и ПЛШ с липидами, выбранными в качестве биомаркеров (красный цвет) в положительных и отрицательных моделях (n = 8-10).
3.7. Корреляции между ключевыми микробными филотипами, липидами и параметрами, ассоциированными с ПЛШ Корреляционный анализ Пирсона показал, что тесная связь между метаболическими параметрами и липидами значительно меняется в зависимости от введения ПЛШ (рис. S2). Таким образом, эти результаты свидетельствуют о том, что липиды, включая CE, SM, LPE, PE, PG и FFA, могут являться потенциальными биомаркерами, ответственными за коррекцию метаболических нарушений ПЛШ у мышей на ВЖД. Более того, исходя из данных корреляционного анализа Спирмена между идентифицированными видами бактерий и содержанием определенного маркерного липида (рис. S3), численность родов бактерий, увеличиваемая введением ПЛШ (Muribaculum, Akkermansia и Anaeroplasma) отрицательно коррелировала с показателями уровней липидов. Напротив, численность родов бактерий, подавляемая введением ПЛШ (Lactococcus, Mucispirillum, Desulfovibrio и Faecalibaculum) показала положительную корреляцию, то есть, ПЛШ может влиять на метаболизм липидов посредством регулирования микробиоты кишечника.
4. ОБСУЖДЕНИЕ Листья шелковицы белой коммерчески легко доступны в качестве пищевых продуктов и фармацевтических препаратов. Благодаря множеству биологически активных компонентов листья шелковицы являются микроэкологическим модулятором и могут быть использованы для профилактики и лечения ожирения и других проблем со здоровьем. В данном исследовании на протяжении 20 недель введения ПЛШ оказывает выраженный защитный эффект на метаболизм. Мы не наблюдали явных побочных эффектов ПЛШ у мышей, содержавшихся на ВЖД. Полученные данные показали, что ПЛШ при дозах 100 мг/кг/день (ПЛШ) может служить перспективным, эффективным и безопасным терапевтическим агентом при метаболических нарушениях. Мы обнаружили также, что введение ПЛШ не влияет на потребление калорий. Тем не менее, ПЛШ предотвращает избыточное накопление жира в организме, что сдерживало ожирение. Аналогичным образом, листья шелковицы значительно снижали прирост массы тела и жировой массы мышей в условиях ВЖД (Li et al., 2011; Sheng et al., 2019; Xu et al., 2017; Zhang et al., 2018). Это означает, что благотворные эффекты листьев шелковицы, препятствующие ожирению, могут быть связаны с функциональными полисахаридами. Кроме того, сообщалось, что некоторые соединения из листьев шелковицы, такие как флавонолы, кверцетин и рутин, усиливают энергетический обмен (Chen et al., 2016; Kim et al., 2020; Stewart et al., 2008).
Ожирение и связанные с ним хронические воспалительные процессы часто сопровождаются повышением концентрации лептина и, следовательно, вызывают резистентность к данному соединению, все более усиливая метаболические нарушения (Ryan et al., 2020). В связи с этим, высокие дозы ПЛШ потенциально способны снизить резистентность к лептину, вызванную ВЖД. Важно , что причиной ИР при ожирении и сахарном диабете 2 типа является сложное взаимодействие нескольких метаболических путей (Yang et al., 2018). Эти процессы тесно связаны с избыточным накоплением специфических липидов (включая FFA), что приводит к нарушениям синтеза, секреции и передачи сигналов инсулина (Liu et al., 2017). Липидомика, ставшая мощным аналитическим инструментом, фокусируется на анализе обширного комплекса липидных метаболитов и способна выявить конкретные классы липидов при введении ПЛШ. Кроме того, кишечная микробиота играет жизненно важную роль в регуляции метаболизма липидов и глюкозы. В кишечнике липополисахариды (LPS) провоцируют воспаление белой жировой ткани и нарушают метаболизм глюкозы (Caesar et al., 2012). Диета, богатая жирами, связана с системным повышением уровня LPS. В наших экспериментах данный эффект отсутствовал, вероятно, в силу использования рациона с различным содержанием жиров. Добавки ПЛШ значительно уменьшали метаболическую эндотоксемию, вероятно, благодаря регуляции состава микробиоты кишечника и укреплению кишечного барьера. В условиях ВЖД проницаемость кишечника способна повышаться, особенно для соединений с высокой молекулярной массой, таких как LPS, что способствует развитию ИР (Moreira et al., 2012).
Введение ПЛШ существенно влияет на микробное сообщество в кишечнике мыши. После потребления ПЛШ соотношение Ф/ Б в кишечнике значительно снижалось. Данный результат согласуется с предыдущим исследованием эффектов листьев шелковицы на мышах с ожирением, вызванным ВЖД (Sheng et al., 2019), а также с исследованием действия компонента листьев шелковицы дезоксиногиримицина при лечении неалкогольного стеатогепатита, индуцированного ВЖД (Hu et al ., 2019). Описано также увеличение доли Ф/Б в фенотипе с ожирением по сравнению с индивидами нормальной весовой категории. Снижение доли типа Bacteroidetes, в свою очередь, четко связано с ИР, ожирением и гипергликемией (Chen & Devaraj, 2018). Впервые полученные в данном исследовании доказательства того, что ПЛШ восстанавливает разнообразие микробиоты кишечника, нарушенное ВЖД, могут способствовать широкому применению ПЛШ в качестве пищевой добавки с лечебным эффектом в отношении кишечной микрофлоры. Кроме того, для изучения благотворного воздействия ПЛШ на кишечную микробиоту необходимы также клинические исследования.
Ранее сообщалось, что ВЖД значительно увеличивает относительную численность бактерий Desulfovibrio и повышает уровень LPS в плазме, вызывая дисфункцию кишечного барьера (Jakobsson et al., 2015). Соответственно, в настоящем исследовании у мышей из группы ПЛШ были значительно снижены уровни циркулирующего LPS по сравнению с мышами группы ВЖД, в то время как существенной корреляции между ЛПС и Desulfovibrio не наблюдалось (Chen et al., 2019). Увеличение количества Desulfovibrio играет важную роль в высоком уровне ОХ, который может быть восстановлен путем снижения потребления холестерина (Zhang et al., 2021). Lactococcus могут являться условно-патогенными микроорганизмами, не вызывая физических повреждений у мышей с диабетом при введении ПЛШ. Мы отметили, что, в отличие от предыдущих результатов, введение ПЛШ значительно сокращает количество накопленных вследствие ВЖД видов Faecalibaculum (Ke et al., 2019). Кроме того, у мышей с диабетом наблюдалось снижение численности родов Anaeroplasma и Muribaculum по сравнению со здоровыми мышами (Yuan et al., 2020). ПЛШ способен устранить дисбаланс кишечной микробиоты за счет увеличения численности данных бактерий. В качестве биомаркера улучшенного метаболического профиля Akkermansia способствовала снижению уровней FFA и LPS. что указывает на то, что МП способен противостоять метаболической эндотоксемии и воспалительным процессам в жировой ткани за счет обогащения Akkermansia. Это исследование дает новые представления об изменении численности микробных биомаркеров. Потребление ПЛШ приводит к увеличению численности Muribaculum, Akkermansia и Anaeroplasma и уменьшению количества Mucispirillum, Faecalibacullum, Lactococcus и Desulfovibrio. Ожидается, что ПЛШ найдет применение в качестве перспективного модулятора кишечной микробиоты для лечения метаболического синдрома. Вместе с тем, сообщалось о накоплении CE, SM, LPE и PE в плазме мышей с ожирением, вызванным ВЖД (Eisinger et al., 2014; Zhai et al., 2018). SM является одним из самых распространенных фосфолипидов. ВЖД приводит к повышению уровня SM в плазме, печени, скелетных мышцах, жировой ткани и сердечно‐сосудистых тканях. Также ВЖД способствует возникновению ИР, связанной с ожирением, эндотелиальной дисфункции и атеросклероза (Choi & Snider, 2015).
5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, ПЛШ был выделен и охарактеризован диапазоном молекулярных масс 1203-838 кДа и 0,3–203 кДа и составом, насчитывающим восемь моносахаридов. Исследование in vivo на мышах с ожирением, вызванным ВЖД, подтвердило положительные эффекты ПЛШ в отношении метаболических нарушений и резистентности к инсулину, состава кишечной микробиоты и метаболизма липидов. Наши результаты обеспечивают научную основу для рационального применения ПЛШ в клинической практике и предлагают использование ПЛШ в качестве функционально й пищевой добавки при лечении метаболических расстройств.
БЛАГОДАРНОСТИ Авторы выражают благодарность за финансовую поддержку со стороны Национального фонда естественных наук Китая (81830112).
КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ Авторы заявляют, что у них отсутствовал конфликт интересов.
ВКЛАД АВТОРОВ Синь Чжао и Чжифэй Фу внесли равный вклад в эту работу.
ЗАЯВЛЕНИЕ О ДОСТУПНОСТИ ДАННЫХ Данные, подтверждающие выводы этого исследования, доступны у соответствующего автора по запросу.